提高化学去细胞异体神经再生速度和修复长度的实验研究

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1、军医进修学院;解放军总医院博士学位论文提高化学去细胞异体神经再生速度和修复长度的实验研究姓名：于海龙申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：卢世璧;彭江20090525军医进修学院博士学位论文提高化学去细胞异体神经再生速度和修复长度的实验研究中文摘要研究背景周围神经损伤是临床上的难题，目前依然以自体神经移植修复为主要手段，但由于自体神经来源有限且供区有较多并发症，故多年来医学界不断寻找能替代自体神经移植的生物材料。在众多的替代材料中，去细胞异体神经显示了良好的应用前景。化学法萃取去细胞异体神经(ChemicallyExtractedAcellula

2、rNerve．CEAN)，在最大限度地去除免疫原性物质的同时，较好地保存神经内部结构和细胞外基质的活性成分，成为修复周围神经缺损理想材料之一。在我们前期的研究中，已经采用CEAN成功地修复了犬、猴的大段周围神经缺损，取得了良好效果，其有效修复长度范围可达8厘米。应用CEAN桥接周围神经损伤伤后，在再生神经纤维长入靶器官之前，患侧肌肉已发生严重萎缩，提高神经纤维再生速度，减轻肌肉萎缩对修复神经功能至关重要。此外，随着周围神经缺损长度的增加，神经修复效果降低，如何增加移植神经修复长度，已成为周围神经损伤研究重点之一。相关的研究发现，CEAN中存在有利于神经生长

3、的成分，也有不利于神经再生的成分，将这些抑制神经再生的物质去除，并保留促神经再生的物质，将进一步提高CEAN修复周围神经缺损效果。研究目的l对大鼠CEAN蛋白成分进行电泳分析，了解CEAN中免疫原性蛋白残存情况；在CEAN切片上，接种背根神经节，观察CEAN结构对神经再生的影响。2为CEAN修复周围神经缺损补充缓释的外源性神经生长因子，观察该方法对神经再生生长速度、肌肉萎缩、神经组织再生情况的影响。3军医进修学院博士学位论文3应用软骨素酶ABC去除CEAN中不利于神经再生的物质硫酸软骨素蛋白多；糖(ChondroitinSulfateProteoglyea

4、n，CSPG)，修复大鼠坐骨神经长距离缺损，评价去除CSPG对修复缺损距离的影响。研究方法第一部分CEAN蛋白成分及结构特性按Sondell法制备大鼠的CEAN，将制备好的CEAN进行电泳分析，观察28．30kDa区域的髓鞘蛋白的残留情况；将CEAN进行冰冻切片，接种鸡胚背根神经节，进行神经纤维荧光染色，观察神经纤维在CEAN切片上的生长方向。第二部分神经生长因子(NGF)复合缓释制剂对提高CEAN修复周围神经缺损的实验研究采用复乳溶媒蒸发一萃取法，以聚乳酸羟基／乙酸共聚物为材料制备NGF微球，与纤维蛋白胶混合制备成补充外源性NGF复合缓释制剂。体外进行N

5、GF复合缓剂药物释放曲线，与鸡胚背根神经节共培养鉴定释放NGF的活性。体内实验，以桥接大鼠坐骨神经10mm缺损为模型，分为自体神经移植组(A组)，CEAN+NGF复合缓释割剂组(B组)；CEAN移植组(C纽)：CEAN移植+纤维蛋白胶组(D组)，术后两周测量神经再生生长距离，术后4个月进行神经电生理、腓肠肌湿重、计算机图像分析等方面评价神经移植后的再生效果。第三部分去除CEAN中的CSPG对修复周围神经缺损的实验研究CEAN经软骨素酶ABC降解CSPG后，进行免疫组化染色，观察CSPG去除效果和对去细胞异体神经其它成分的影响。经软骨素酶ABC处理后的CSP

6、G修复周围神经缺损为实验8生t(A组)，桥接大鼠20ram周围神经缺损，对照组不作处理(B组)，术后3个月，评价其修复周围神经效果。研究结果第一部分：CEAN电泳结果显示：28．30kDa区域髓鞘蛋白完全消失，化学萃取的去细胞神经可以完全去除髓鞘蛋白；背根神经节发出大量的神经纤维沿着CEAN基底膜管方向生长；而CEAN切片外侧仅有少量神经纤维生长。第二部分：体外实验证明，NGF复合缓释制剂可持续释放NGF达60天4军医进修学院博士学位论文以上，释出的NGF可促进鸡胚背根神经节神经纤维突起生长，具有较强的生物学活性。术后2周A组神经再生距离比其他组长(P

7、．05)，B组优于c和D组(P<0．05)；C、D组间无差异无统计学意义(P<0．05)。术后16周，A、B、C及D组小腿三头肌收缩力恢复率分别为85．33％士5．59％、69．79％--k5．31％、64．460／钍8．49％、63．35％士6．40％；A组优于其他3组(P<0．05)，B、C、D组间差异无统计学意义(P<0．05)。A、B、C及D组肌肉湿重恢复率分别为62．54％+8．25％、53．73V社4．56％、46．37％士5．68％、45．78％士7．14％：A组三头肌湿重恢复率好于其他3组(P<0．05)，B组好于c和D组妒

8、、D组间无差异无统计学意义俨