改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

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1、改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究作者：王冠军，孙明学，卢世璧*，许文静，赵斌，彭江，张莉，黄靖香【摘要】目的］改进去细胞异体神经化学萃取制备方法，制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。［方法］SD大鼠14只，取双侧坐骨神经（共28根），分3组进行化学萃取去细胞处理：Sondell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠；改良法组所用萃取剂为TritonX-200、SB-10和SB-16；对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察

2、，并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。［结果］在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明，改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1＞0.05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3＜0.05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性３方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于So

3、ndell法（P4＜0.05）。［结论］综合运用萃取剂TritonX-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。【关键词】周围神经；化学萃取；去细胞异体神经　　自体神经移植是目前临床上修复周围神经缺损的“金标准”，但有诸多缺点：增加手术创伤，造成供区功能障碍；且因供体有限，常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。异体神经是人们一直想利用的自体神经移植替代材料，但是新鲜异体神经移植会导致移植失败的免疫排斥反应。采用化学萃取方法能较好地

4、降低异体神经的免疫反应，但处理不同，有时对神经的结构破坏太大。目前已认可的化学制备方法有Sondell法，即运用萃取剂TritonX-100和脱氧胆酸钠。但此法仍有许多待改进之处［1］，神经基底膜管及细胞外基质结构仍存在不同程度的破坏，影响神经的再生。本研究旨在进一步改良去细胞异体神经的制备方法，在清除神经免疫原性物质的同时，较好地保存了其三维网管状结构，以期研制出一种更为理想的去细胞异体神经移植物。　　1材料与方法　　1.1实验动物　　雄性健康成年SD大鼠14只(解放军总医院动物中心提供)，体重270～300g/只。　　1.2实验仪器、试剂　　回旋式恒温振荡器(上海)，环境扫描电镜（QUA

5、NTA400，清华大学提供），TritonX100，脱氧胆酸钠，TritonX200，sulfobetaine-10(SB-10)，sulfobetaine-16(SB-16)，上述试剂均购自美国Sigma公司。　　1.3去细胞异体神经的分组及制备　　取14只大鼠，用10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉后,切取双侧坐骨神经，每根神经长约20mm，共28根神经。仔细剔除神经外脂肪、血管及结缔组织。分3组进行处理：Sondell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为：TritonX-100和脱氧胆酸钠，步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12h；（2）3%

6、TritonX-100溶液中振荡萃取12h；（3）4%脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；（4）重复上述步骤1次；（5）蒸馏水冲洗30min。改良法组所用萃取剂为：TritonX-200、SB-10和SB-16，步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12h；（2）125mmol/LSB-10溶液中振荡萃取12h；（3）0.14%TritonX-200和0.6mmol/LSB-16溶液中振荡萃取24h；（4）重复上述步骤1次；（5）PBS（pH=7.2,下同）冲洗30min。2种方法处理均在25℃下进行，处理后的神经于4℃下、PBS液中储存备用。对照组神经不作化学处理。　　1.4去细胞异体神经的组织学评价

7、　　1.4.1光镜观察3组各取神经6、6、4根，于各神经同位置处切取神经（横向切片取5mm长神经，纵向切片取10mm长神经），常规石蜡包埋,厚为5μm的横向和纵向组织学切片；HE染色,观察去细胞程度和围绕神经轴突的基底膜管结构的完整性；快蓝染色,观察髓鞘残留成分；基底膜素免疫组化染色，观察基底膜素的保留。　　1.4.2扫描电镜观察3组各取神经4根，于2%OsO4（2%锇酸）溶液中固定24h后，二甲胂酸钠缓冲液