三羟基异黄酮对关节软骨细胞合成胶原和蛋白多糖的影响

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万方数据44f)_复里季搪(医学版)FudanUnivJMedSci三羟基异黄酮对关节软骨细胞合成胶原和蛋白多糖的影响张超陈飞雁6夏军姜建元黄煌渊(复旦大学附属华山医院骨科上海200040)【摘要】目的通过对体外培养软骨细胞的实验研究，探寻受体酪瓴酸激酶抑制剂对软骨细胞在细胞分子水平的影响及其可能机制。方法对软骨细胞进行原代及传代培养。通过对培养细胞形态学及甲苯胺蓝染色观察．选择适合传代软骨细胞，应用三羟基异黄酮干预后1、2、3、4天RT—PCR、ICC及甲苯胺蓝染色观察法比较药物干预对体外培养软骨细胞I、Ⅱ型胶原的转录和翻译水平及蛋白多糖的表达变化。结果20弘g／mL及25『』g／mL三羟基异黄酮干预可以抑制I型胶原表达．同时增加Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达。结论三羟基异黄酮可以抑制脂多糖刺激诱导的软骨细胞反分化，对体外培养关节软骨细胞的正常表型具有一定的保护作用。其保护作用与三羟基异黄酮浓度呈现一定的相关性。【关键词】蛋白多糖；I、II型胶原；受体酪氨酸激酶抑制剂【中图分类号】Q813【文献标志码】ATheeffectofreceptortyrosinekinaseinhibitorgenisteinonphenotypeexpressionofcollagenandproteoglycanofchondrocyteZHANGChao，CHENFei—yanA，XIAJun，JIANGJian—yuan，HUANGHuang—yuan(DepartmentofOrthopaedics，HuashanHospital。FudanUniversity，Shanghai200040，China)[Abstract]ObjectiveToexploretheprotectiveroleofthereceptortyrosinekinaseinhibitorinchondrocyteinvitro．MethodsReversetranscription—polymerasechainreaction(RT-PCR)。immunoeytochemistry(ICC)andtoluidinebluestainingwereusedtounderstandthechangesofphenotypeexpressionofcollagenI，11andproteoglycaninchondrocyteinvitro．ResultsGenisteinof20t_￡g／mLand25／Mg／mLconcentrationsdecreasedtheexpressionofcollagenIandincreasedtheexpressionofcollagen1Iandproteoglycan(P<(J．115)．ConclusionsThisstudyshowesthatgenisteincaneffectivelyinhibittheexpressionofcollagenIabovecertainconcentration，anditcanimprovetheexpressionofcollagenIIandincreasethesynthesisofproteoglycan．[Keywords]proteoglycan；collagen；receptortyrosinekinaseinhibitor原发性骨关节炎(osteoarthritis，oA)是一种常见的以关节软骨慢性进行性退变为特征的关节疾患。在西方，女性疾病中排名第4位，男性疾病中排名第8位。流行病学资料表明我国65岁以上老年人患病率高达5(J％，并随年龄增大而上升。但是由于对骨关节炎确切的发病机制不清楚，目前对于骨关节炎无论是药物治疗还是手术治疗都只能是对症处理，而不能从根本上针对骨关节炎的病因进行处ACorrespondingauthorE—mail：chenfy73@hotmail．eom理。近年有研究发现体外培养大鼠软骨细胞表达盘状结构域受体(I)DR2)，其在骨关节炎中的表达明显升高川。o，提示其在骨关节炎中的重要作用，盘状结构域受体是一种受体酪氨酸激酶，广泛分布于多种组织，DDR2的表达水平与基质金属蛋白酶的表达成正相关，在骨关节炎中DI)R2的表达明显升高，这些都提示着蛋白酪氨酸激酶在骨关节炎症的发病机制中可能存在重要作用。三羟基异黄酮 万方数据张超．等．三羟基异黄酮对关节软骨细胞合成胶原和蛋白多糖的影响(genistein)作为天然的酪氨酸激酶抑制剂，对多种蛋白的酪氨酸激酶活性具有抑制作用，本实验通过研究genistein对体外培养软骨细胞I、Ⅱ型胶原在转录和翻译水平表达的影响，及对蛋白多糖表达的影响，初步探讨genistein在骨关节炎治疗中钧作用。材料和方法细胞原代培养和传代4周龄新西兰白兔4只(上海中医药大学实验动物部)，无菌条件下切取股骨髁和胫骨平台关节软骨漂洗后，剪成1mmj大小，0．25％胰蛋白酶37℃预消化15min，然后用0．2％胶原酶37℃消化，每隔45min收集1次消化产物共4次，经筛网过滤、1000r／min离心5min后弃上清，所分离得到细胞漂洗离心后加入2(J％小牛血清DMEM培养液，以2X105个／cm2接种于25cm2培养瓶内，置人I)-6450型细胞培养箱(37℃、5％C02)培养。48h后换液清除未贴壁细胞和组织，以后隔日换液。显微镜下观察到贴壁生长的单层细胞融合成片时即可传代。将传代细胞接种于25cm2培养瓶(密度2X105个／cm2)，镜下观察细胞达到亚融合状态后，换1％血清培养基过夜培养。刺激干预实验分为以下7组进行研究：正常对照组、10tLg／mLLPS刺激组以及10弘g／mLLPS刺激+不同浓度genistein干预组(工～V：分别为5gg／mL、10,ug／mI。、15,ug／mI，、20弘g／mL及25t-g／mI。)。软骨细胞经刺激干预后收集后用于RT—PCR检测，ICC和甲苯胺蓝组化染色。I型、Ⅱ型前胶原mRNA表达检测(RT-PCR)引物设计合成根据Genebanki型、Ⅱ型前胶原序列用DNAstar软件设计引物如下：I型前胶原：上游5，_GATGGCCTGAAGCTCAA-3’，下游：5'-GGTTTGTTGAAGAGGCTG-3’，扩增产物长度312bp；11型前胶原：上游：5’-AACACTGCC-AACGTCCAGAT一3’，下游：5’一CTGCAGCACGG—TATAGGTGA一3’，扩增产物长度201bp。总RNA的抽提及其质量鉴定收集培养瓶内软骨细胞，加入1mLTrizol液，匀浆。22℃，静置5min，加入氯仿0．2mL，颠倒15S。22℃下静置3rain，4℃、15000g离心15min，取上清液0．4mL加入等体积异丙醇，混匀，22℃下静置3min，4℃、15000g离心15min，弃上液，加入1mL4℃75％乙醇，4℃、15000g离心5min，弃上液，真空干燥5min，用25”LDEPC处理水溶解，取小部分用于总RNA紫外分光光度定量和1％琼脂糖凝胶电泳观察，其余置于一7()℃低温保存。RT—PCR4×dNTP(each10mmoI。)1gL，随机引物(100t比moL)4弘L，及总RNA2弘g，加水至12弘L，65℃变性5min后转冰盒，再加入5Xbuffer4“L，DTT(100mm01)2￡上L，RNAsin(40U／L)，25℃10min，加入M-MLVRT反转录酶(200U／t．tL)1弘I。，37℃51)min，70℃15min(灭活逆转录酶)，一21)℃保存。dNTP(each2．5mmoL)2“I，，10×buffer4ttL，上游引物(5ttmoL)2t．tI。，下游引物(5}tmoL)2弘L，反转录产物4弘L以及TaqDNA聚合酶(5U／t卫L)0．4tLL，加水至40肛L，94℃变性3min，94℃41)S，55℃1min，72℃1min，30个循环扩增，取PCR产物25“I，与GAPDH10t．tI，加上样缓冲液5“L混匀后，上样于1．6％的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNAmarker，80V电压，电泳1h。凝胶分析系统观察拍照分析。甲苯胺蓝染色干预72h后取出24孔培养板中的盖玻片，PBS冲洗，4％中性甲醛溶液固定30min，用1％甲苯胺蓝染色30min，迅速用无水乙醇漂洗1次，空气中干燥，脱水透明，封片后光镜观察ECM蛋白多糖异染情况。免疫细胞化学(immunocytochemistry。ICC)。干预72h后取出24孔培养板中的盖玻片，ICC检测I、Ⅱ型胶原。4％多聚甲醛固定20min，3％过氧化氢室温下10min，抑制内源性过氧化酶活性。抗原修复液37℃2min。山羊血清封闭液处理玻片10min。依次加入抗体(一抗)，37℃湿盒孵育2min；力Ⅱ入二抗(生物素标记IgG)37℃湿盒孵育20min；链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶溶液37℃湿盒孵育30min。上述各步骤均以PBS冲洗，DAB显色，甲基绿复染，脱水透明后中性树脂封片。应用0lympusBH-2光学显微镜观察，阳性细胞表现为胞质和／或基质中出现棕褐色颗粒。应用LeicaQw550图像分析软件计数阳性细胞所占比例，随机检验10—20视野，每张切片至少计数1000个软骨细胞，结果以阳性细胞比例表示，阳性细胞比例=(阳性细胞数／细胞总数)×100％。统计学处理应用SPSS11．0统计学软件对计量结果进行单因素方差分析，组间两两比较，结果以平均值±标准差表示，P0．05)。Ⅱ型胶原阳性细胞表达空白对照组软骨细胞胞浆和基质内可见明显Ⅱ型胶原阳染颗粒；LPS刺激后Ⅱ型胶原阳染颗粒减少，genistein干预后阳染颗粒增多。组间两两比较，I。PS刺激组和空白对照组、LPS刺激组和20Mg／mL及25ptg／mI，genistein干预组阳性细胞比例比较，P<0．05，有统计学意义；20tug／mL及25t．￡g／mI。genistein干预组和空白对照组间比较，P>(J．05，无统计学意义。RT-PCR结果I型前胶原LPS刺激组在细胞培养1d后，即可见有弱阳性条带显示，且阳性表达随着培养时间的增加又逐渐增高，LPS刺激+不同浓度genistein干预后I型前胶原表达趋势类似于LPS刺激组，但I型前胶原表达水平低于LPS刺激组细胞，其中20Mg／ml。及25／49／mI。浓度genistein干预I型前胶原mRNA表达水平与LPS刺激组比较，PO．05，不具有统计学意义。Ⅱ型前胶原LPS刺激后亦可见有Ⅱ型前胶原mRNA阳性表达，但随着培养时间增加Ⅱ型前胶原mRNA表达的增加趋势明显低于空白对照组，各检测时间表达水平两者比较，P【J．05，不具有统计学意义。琴12：10爱8笔6喜4‘莒2山O图2各组I型胶原软骨细胞阳染百分比Fig2PositivearearateofcollagenIofdifferentgroupswithimmunocytochemistry2000806040200图3各组Ⅱ型胶原软骨细胞阳染百分比Fig3PositivearearateofcollagenIofdifferentgroupswithimmunocytochemistry 万方数据张超。等．三羟摹异黄酮对关节软骨细胞合成胶原和蛋白多糖的影响图4各时间各组I型前胶原mRNA表达Fig4ExpressionofcollagenImRNAofdifferentgroupsatdifferenttimepoints图5各时间点各组Ⅱ型前胶原mRNA表达Fig5ExpressionofcollagenⅡmRNAofdifferentgroupsatdifferenttimepoints讨论体外软骨细胞的培养软骨细胞在体外培养过程中出现两种转归：一是继续维持表型；二是发生反分化；Darling等[33通过对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的变化的测定，认为传代对细胞表型影响很大，即使在体外的三维培养中也不例外，国内张志光等H1研究认为在5代以内软骨细胞表型保持稳定，但这可能与实验动物的年龄、细胞接种的密度以及培养的条件相关，在本实验中我们观察可见3代以内的软骨细胞活性强，3代以后的细胞逐渐出现反分化，所以选用了第2代软骨细胞作为实验对象，第2代软骨细胞活性高，保持细胞的表型，是理想的实验细胞。genistein对关节软骨细胞胶原和蛋白多糖表型变化的影响工型胶原是脊椎动物体内最丰富的胶原，由2条a1链和1条a2链构成。在体内，I型胶原总是与Ⅲ型胶原和／或V型胶原形成胶原纤维杂聚体。目前有研究认为正常关节软骨细胞不表达I型胶原mRNA，不合成I型胶原【5]。在我们实验中空白对照组中未见有I型前胶原mRNA表达，这与正常软骨细胞不表达I型胶原mRNA相一致。而根据我们RT—PCR和ICC的结果所见正常软骨细胞在LPS刺激后出现I型胶原的表达，且随着刺激时间增加而逐渐升高，认为骨关节炎软骨细胞可以合成I型胶原，而在LPS刺激后+genistein干预组(特别是20ptg／mL及25ug／mL)，软骨细胞I型胶原表达较LPS刺激组明显有下降趋势，提示受体酪氨酸激酶抑制剂genistein具有抑制降低I型胶原表达的作用，而工型胶原作为软骨细胞去分化的经典标志物，所以可以认为受体酪氨酸激酶抑制剂genistein在转录和翻译水平上具有阻止软骨细胞反分化的作用。Ⅱ型胶原分布于软骨组织中，是软骨细胞的特征性表型，由3条a1链组成，是关节软骨的重要成分，均匀分布于整个软骨层，占关节软骨中胶原总量的8()％～85％[6]，Ⅱ型胶原赋予软骨良好的张力和抗剪切力。它的表达量减少同样也是体外软骨细胞培养反分化时重要特征，而在骨关节炎软骨退变、基质降解、失染的同时也有Ⅱ型胶原的减少。我们的实验中观察到正常的软骨细胞可表达Ⅱ型胶原，这可能对维持正常的关节软骨基质的降解和合成代谢平衡具有意义，而在LPS刺激后关节软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力有所下降，提示骨关节炎关节软骨基质的合成代谢能力下降，而在应用genistein干预后，软骨细胞合成Ⅱ型胶原的水平有一定的恢复，提示genistein对体外培养软骨细胞的胶原表型具有一定的保护作用。关节软骨基质的另一主要成分是蛋白多糖(PG)。PG在细胞间信息传递、维持细胞表型、与其他基质间相互作用及保持组织整体功能方面发挥着极其重要的生物学功能，PG由核心蛋白和糖氨聚糖链共价连接形成聚合体。机械应力、MMPs和细胞因子IL一1B，TNF—a等许多因素导致了oA软骨PG的变化。我们在研究genistein对体外培养关节软骨细胞代谢影响的过程中参考Terry等H1的方法应用甲苯胺蓝行组化染色，在组织学水平观察培养软骨细胞PG表型的表达情况。甲苯胺蓝能使PG中的CS等异染成紫色或紫红色，而其余组织呈不同程度的蓝色，利用本原理结合细胞的外形特征可以对实验软骨细胞进行PG表型鉴定。实验观察显示：空白对照组组载玻片单层细胞甲苯胺蓝染色基本正常；LPS刺激软骨细胞甲苯胺蓝染色以浅蓝色为主，ECM染色变浅，细胞稀疏并出现较多梭形细胞，提示LPS刺激诱导后体外培养关节软骨细胞PG合成能力降低，表型发生改变，但经20ug／mL及25btg／mL浓度genistein干预的LPS诱导软骨细胞的甲苯胺蓝染色结果和空白对照组软骨细胞基本一致。由此可以推论，一定浓度的genistein可以保护体外培养的正常关节软骨细胞PG的表型维持。 万方数据444复旦学报(医学版)2009年7月，36(4)总结：通过本节实验RT—PCR和ICC观察了genistein对体外培养软骨细胞I、Ⅱ型胶原在转录和翻译水平表达的影响，并应用甲苯胺蓝染色观察了genistein对蛋白多糖表达的影响。结果显示genistein可以抑制LPS刺激诱导的软骨细胞反分化，即抑制软骨细胞异常胶原的表达并维持正常Ⅱ胶原和PG的表达，对体外培养关节软骨细胞的正常表型具有一定的维持保护作用，且genistein的保护作用与genistein浓度呈现一定的相关性。[1]F23[3]参考文献WangJC。LuHS，I．iuXP。eta1．Functionalanalysisofdiscoidindomainreceptor2insynovialfibroblastsinrheumatoidarthritisFJ]．ArthritisAutoimm，2002，19(3)：161—168．LinX。PengHB．WuDY。eta1．Activationofthediscoidindomainreceptor2inducesexpressionofmatrixmetalloproteinase13associatedwithosteoarthritisinmice[J]．BioChem．2005，280(1)：548—555．DarlingEM，AthanasiouKA．Rapidphenotypicchangesin(上接第426页)E4]E5][61[7]passagedarticularchondrocytesubpopulation[J]．OrthopRes．2005．23(2)：425—432．张志光。郑卫平．苏凯。等．兔关节软骨细胞的分离培养和形态学特征EJl．中山大学学报：医学科学版。2004，25(1)：63—66．LorenzH，WenzW，IvancicM，ela1．EarlyandstableupregulationofcollagentypeⅡ．collagentypeIandYKL40expressionlevelsincartilageduringearlyexperimentalosteoarthritisOCCURSindependentofjointlocationandhistologicalgrading[J]．ArthritisResTher．2005。7(I)：R156一R165．MichaelAC。EdwardFR．Thecartilagecollagens：areviewoftheirstructure，organization，androleinthepathogenesisofexperimentalarthritisinanimalsandinhumanrheumaticdiseaseFJ]．JMolMed．1998．76：275—288．TerryDE．ChopraRK。OvendenJ，订a1．DifferentialuseofAlcianblueandtoluidinebluedyesforthequantificationandisolationofanionicglycoconjugatesfromcellcultures：applicationtoproteoglyeansandahigh-molecular-weightglycoproteinsynthesizedbyarticularchondrocytes[J]．AnalBiochem，2000，285(2)：211—219．[13Ortho-MeNeilUhracet．Tramadolhydrochloride／acetaminophentablets[EB／OL]．[2008—08-10]．http：／／www．iconocast．corn／00(113／G1／News2．htra．F2][3]F4][5]RaffaRB．Pharmacologyoforalcombinationanalgesics；rationaltherapyforpainEJ]．JClinPharmacolTherap．2001．26(4)：257—264．TanZR，OuyangDS．ZhouG．eta1．DeterminationoftramadolandparacetamolinhumanplasmabyliquidchromatographyIontrapmassspectrum[J]．ChinJVharmAnal．2005。25(7)：795—798．ZhuT。DingL，GuoXF。ela1．SimultaneousdeterminationoftramadolandacetaminopheninhumanplasmabyLC··ESI·-MS[J]．Chromatographia．2007．66(3)：171—178．WangM，WenAD．ZhaoL。etal．Pharmacokineticsandrelativebioequiv2alenceoftramadolhydrochlorideinhealthyvolunteers[J]．JFourthMilMedUniv。2003。24(20)l19(12一[6][7][8][9](收稿日期：2008—08—26；编辑：王蔚)1904．SunKX，FanHW，WuLH。甜a1．MutipledosepharmacokineticandbioavailabilityoforaladministrationsustainedreleaseandconventionaItabletsoftramadolhydrochloride[J]．ChinJClinPharmacol，1999，15(3)：199—202．ZhaoDX．WangYH。XiaDY．eta1．PharmacokineticsofasingledosetramadolhydrochlorideinMongolianandHanhealthyvolunteers[J]．ChinJClinPharmac01．2008．24(2)：126—129．TangCP．JinMZ。ChenYY，eta1．Studiesonbioavailabilityandpharmacokineticsoffilm-coatingspecialshapedtabletofacetaminophen[J]．ChinPharmJ。1999．34(12)：829—831．ZhaoY。RuanZR。YuanH．eta1．PharmacokineticsandbioavailabilityoftabletPVP—AcetaminopheninhealthyvolunteersafterasingleoraldosestudyEJ]．ChinJClinPharmacol。1995．11(4)：229—233．(收稿日期：2008—10—17l编辑：王蔚)