SNT1110-2002新城疫病毒分离及鉴定方法.pdf

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1、新城疫病毒分离及鉴定方法ProcedureofvirusisolationandidentificationforNewcastlediseaseSN／T1110—2002前言本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版)，并参考农业部《新城疫检疫技术规范》，结合我们的操作经验编写、制定。本标准的附录A、附录B均为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准起草人：单松华、胡永强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围本标准规定

2、了禽类新城疫病毒(NDV)分离及鉴定方法。本标准适用于禽类新城疫病毒的分离及鉴定。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修改，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册>>(2000年，第四版)3材料准备所用试剂均为分析纯。3.1普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50μL可调移液器、恒温箱、超净工作台、塑料采血管等。3.2抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素和制菌霉素等。3.39～11日龄无特定病原体

3、(SPF)鸡胚、1日龄SPF鸡和6周龄SPF鸡。3.4pH7.O或至pH7.40.01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录A标准的附录)。3.5阿氏液(红细胞保存液)的配制(见附录B标准的附录)。3.61％鸡红细胞：采集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液中，用20倍体积的PBS洗涤3～4次，每次以2000r／min离心(3～4)min，最后一次5min，用PBS配成1％悬液。4℃保存悬液，在72h内使用完。3.7拭子准备：将脱脂棉缠于牙签的钝端，使其形成直径O.4cm的脱脂棉球，然后用牛皮纸包扎，每捆10只

4、，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。或直接购买商品用拭子。3.8标准新城疫病毒、标准阳性血清：由指定单位供应。4样品采集和制备4.1样品采集4.1.1活禽采集气管拭子和泄殖腔拭子(沾有粪便)；雏禽采集新鲜粪便。4.1.2死禽采集口鼻拭子、肺、肾、肠(含内容物)、脾、脑、肝、心等组织，样品可单独采集或者混合，肠内容物常需单独处理。4.1.3病程长的ND病鸡或非典型ND病例可采集骨髓。4.1.4将无菌采集的样品装入灭菌的小瓶中，并标记清楚(编号、采样时间)，样品立即送实验室处理或于-30℃冷冻保存。4.2样品制备4.2.1取采集样品置于研磨

5、器中磨碎，加入PBS制成10％～20％(W／V)的悬液；采集的拭子浸入(2～3)mLPBS中，充分振荡，反复挤压，弃去拭子。4.2.2在不超过25℃的室温下，1000r／m离心(10～15)min。4.2.3上清液加入抗生素。使用何种抗生素视具体情况而定，常使用的抗生素终浓度为：青霉素(2000IU／mL)，链毒素(2mg／mL)，庆大霉素(50μg／mL)和制菌霉素(1000IU／mg)；粪便和泄殖腔拭子样品，抗生素量提高5倍。加入抗生素后用0.2mol／L磷酸氢二钠(见附录A1.1)调节pH至7.0～7.4。4℃作用4h或过夜，或室温作

6、用(1～2)h，或37℃作用30min，以确保无菌。或上清液经0.45μm滤膜过滤除菌。或上清液5000r／m离心10min后，移出上清液，再8000r／m离心10min，取上清液进行下一项试验。4.2.4上述除菌液应尽快进行试验。如没有条件，可在-30℃冷冻保存。5操作方法5.1病毒分离培养5.1.1细菌污染检查将上述除菌液接种于灭菌的普通营养琼脂平板上，37℃培养24h，检查有无细菌生长。当有细菌生长时，应按4.2.3法，进一步作无菌处理。5.1.2鸡胚接种用1mL注射器吸取上述除菌液，经尿囊腔接种至少5枚9～11日龄SPF鸡胚，每胚0

7、.2mL，置于(35～37)℃孵育4～7d。5.1.3培养物的收集及检测弃去24h内死亡的鸡胚。收集24h以后死亡的和频死的以及孵化结束时存活的鸡胚，置4℃冰箱(4～24)h，收集其尿囊液。用血凝试验检测尿囊液的血凝(HA)活性，采用固定抗体稀释病毒法，方法参见SN／T1109—2002。HA阴性者至少用9～11日龄SPF鸡胚再传代一次。5.2病毒鉴定HA阳性的尿囊液必须用新城疫病毒阳性血清进行血凝抑制(HI)试验，以确定NDV的存在，方法见SN／T1109—2002。5.3毒力测定评价NDV分离株的致病性强弱，可采用以下方法中的一个或几个

8、进行。5.3.1鸡胚平均致死时间(MDT)5.3.1.1将新鲜的感染尿囊液，用灭菌生理盐水连续10倍递增稀释成10-6,～10-9四个不同稀释度。5.3.1.2每个稀释度分别经尿