病毒分离鉴定技术

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1、猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状［1］。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。H前该病匕在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等［4］于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行［5］。河南某猪场”猪场发生临床症状疑似PRR

2、S的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV,并对其进行了一系列的鉴定。1材料与方法1.1材料1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。1.1.2细胞及血清细胞系Marc­145、Vero、PK­15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录Buffer、M­MLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；其

3、他常规试剂均力分析纯;UNIQ­10柱式Trizol总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.1.4RT­PCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株0RF5核苷酸序列，参照文献［6］自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物Pl5'­CTGGAGCCGTGCTATCAT­3z；下游引物P25'­TCCATTTCATGACACCTG­3'o1.2方法1.2.1细胞培养生长液为含100mL/L新生牛血清(NCS)的RPMI­1640培

4、养液；维持液为含20mL/LNCS的RPMI­1640培养液。Marc­145、Vero和PK­15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37'C培养至单层后传代培养。1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍〜10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5000r/min离心30min,上清悬液用0.22um微孔滤膜过滤后，一20°C保存备用。1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1mL分别接种于长成单层的Marc­145细胞、Vero细胞和PK­15细胞，37°C吸附1h，补加

5、维持液至8mL,继续培养3d〜5d,反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。1.2.4分离毒的毒价滴定(TCID50)采用微量法按参照文献［7］进行，测定其在Marc­145上的TCID50,结果按Reed­Muench氏法计算。1.2.5病毒中和试验采用固定病毒­稀释血清法，按参照文献［7］进行，并按Reed­Muench氏法计算中和指数。1.2.6分离毒的动物回归试验将107.5TCID50/mLHN株病毒细胞培养

6、液经口鼻途径接种30口龄健康猪2头，3.0mL/头，并设1头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照，隔离饲养，每日测体温，并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现，1周左右剖检观察其病变。然后分别采集接种猪和阴性猪的肺脏、淋巴结等组织，用作PCR检测。1.2.7RT­PCR鉴定1.2.7.1病毒基因组总RNA的提取按总RNA抽提纯化试剂盒说明提取。1.2.7.2反转录(RT)0.8ULMgC12(25mmol/L)、4.0uL反转录buffer(5X)、2uL：dNTP(10mmol/L)>1.0nLPl(25pmol/L)、1.0ULP2(25pmol/L)、

7、1.0uLRNasin(40U/uL)、9.2uL总RNA,然后置于PCR仪上65°C15min后’加入M­MLV(5U/uL)1.0pL，最后于42°C1h，95°C5min结來反应。1.2.7.2PCR反应1.4uLMgC12(25mmol/L)>4.0uLbuffer(10X)、0.6PLrTaqB(5U/uL)>10PL模板cDNA,置于PCR仪中扩增。反应参数为：95°C5min；94°C1min,55°C30s,72°C1min,共进行35个循环；最后72°C10min。结束后将PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定