《病毒分离鉴定》PPT课件.ppt

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1、第三节病毒分离及鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒.病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体潜伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见最多查见很难查见未增多未增多或增多不明显明显增多（常超过4倍）一、标本的处理（一）除菌处理粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。对乙

2、醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。（二）研磨和稀释对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（pH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织悬液，然后经2000转／分离心20分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。二、病毒的分离培养(一）动物接种法接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择

3、适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。动物接种的优缺点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；（2）技术简单；（3）易成功缺点：（1）个体差异大（2）价格昂贵（3）数量有限（4）需要隔离畜舍（二）鸡胚接种1.鸡卵的选择一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。2.孵育孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。3.检卵鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。（1）未受

4、精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。（2）活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。（3）死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查（图7-8）。常用于流感病毒的初次分离。鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查（图7-7）。常用于某些嗜神经病毒的分离。4.接种绒毛尿囊膜接种：

5、用10～l2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开—小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上．孵育后。观察膜上有无斑点病变(图7-10)。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查(图7-9),常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。5.剖检及收获收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。鸡胚接种的优缺点：优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量

6、可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。(三）细胞培养根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种。细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。原代细胞培养即从机体内取出细胞置试管或瓶内生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病毒疫苗.这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和传代,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和地鼠肾原代细胞。传代细胞它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的,染色体数为非整倍体,细胞随时可以获得,生长迅速,可无限传代.细胞培养的方法静置培

7、养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。病毒的获得优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；无个体差异，准确性和重复性好；可严格执行无菌操作；细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；应用空斑技术可进行病毒的克隆化。三、病毒鉴定1.形态学鉴定细胞病变效应（cytopath

8、iceff