炎性因子TNF-α对BMP-2及BMP-9所介导的SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

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1、分类号：R782单位代码：10159密级：公开学号：201521162硕士学位论文（口腔医学硕士学术学位）中文题目：炎性因子TNF-α对BMP-2及BMP-9所介导的SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响英文题目：TheEffectofTNF-αatBMP-2/BMP-9inducedOsteogeneticDifferentiationofBoneMarrowStemCellsofSDRat论文作者：朱彤指导教师：卢利教授学科专业：口腔临床医学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文炎性因子TNF-α对BMP-2及BMP-9所介导的SD大鼠骨髓

2、间充质干细胞成骨分化的影响TheEffectofTNF-αatBMP-2/BMP-9inducedOsteogeneticDifferentiationofBoneMarrowStemCellsofSDRat论文作者朱彤指导教师卢利教授申请学位医学硕士培养单位口腔医学院一级学科口腔医学二级学科口腔临床医学研究方向口腔颌面外科论文起止时间2016年9月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月Ⅰ中国医科大学硕士学位论文II中国医科大学硕士学位论文摘要目的：探讨不同浓度BMP-2及BMP-9对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，

3、并进一步探讨在炎性因子TNF-α加入的情况下，不同浓度的BMP-2及BMP-9所介导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的改变，初步了解在炎性条件下，BMP-2及BMP-9对于成骨分化的作用效果。材料与方法：1、细胞提取、培养及鉴定：采用全骨髓冲洗及差速贴壁法分离培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞，流式细胞仪鉴定干细胞表面标记物，成脂及成骨分化验证其多向分化能力2、实验分组：实验以在诱导成骨培养基（OsteogenicmediaOM）中培养的大鼠BMMSCs为对照组，以在OM中加入不同浓度BMP-2、BMP-9及TNF-α为实验组。浓度分别设定为①BMP-2浓度

4、（50、100、150ng/ml）②BMP-9浓度（50、100、150ng/ml）③TNF-α浓度（10ng/ml）④TNF-α（10ng/ml）+不同浓度BMP-2(50、100、150ng/ml)⑤TNF-α（10ng/ml）+不同浓度BMP-9(50、100、150ng/ml)。3、碱性磷酸酶活性检测：AKP试剂盒测定各组碱性磷酸酶活力4、钙结节含量检测：茜素红染色矿化结节观察各组钙结节矿化程度。5、Real-TimePCR检测：检测各组成骨相关指标的ColⅠ、OCNmRNA的表达量6、统计学分析：采用统计软件SPSS23.0软件分析，实验结果以

5、均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为显著性检验标准，作为差异有统计学意义，将分析检验后的实验数据应用GraphPadPrism6.0进行制图。结果：1、细胞提取、培养及鉴定：经流式细胞仪鉴定提取的干细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的阳性表达率分别为100%、2.9%、96.5%、0.8%，茜素红矿化结节染色及油红O成脂染色证实细胞有多向分化能力。2、ALP活性检测结果：与对照组相比，在加入含TNF-α的成骨诱导液进行培养后，在第3、5、7天各时间点，BMMSCs碱性磷酸酶的活性显著降低（P＜0.

6、05）在加入含BMP-2及BMP-9的成骨诱导液进行培养后，BMMSCs碱性磷酸酶活性有明显提升（P＜0.05），并且均在BMP-2及BMP-9浓度为100ng/ml时达到峰值。且含BMP-9的III中国医科大学硕士学位论文培养液所诱导的BMMCs的碱性磷酸酶活性均高于同等浓度的BMP-2。在同时含有BMP-2、BMP-9及TNF-α（④组、⑤组）的成骨诱导培养液中，BMMSCs碱性磷酸酶活性均较同浓度仅含有BMP-2、BMP-9的诱导培养液所诱导的结果偏低，但高于对照组及TNF-α组（P＜0.05）。3.茜素红钙结节染色结果：与对照组相比，在按实验分组

7、加入不同浓度TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨诱导液培养14天后，仅含TNF-α成骨诱导培养液组的钙结节含量减少（P＜0.05），含有BMP-2及BMP-9成骨诱导培养液组钙结节含量显著提升，且含BMP-9诱导培养液组的钙结节含量高于同浓度的BMP-2组（P＜0.05），在加既含有BMP-2、BMP-9及TNF-α（④组、⑤组）的诱导成骨培养液培养14天后其钙结节含量较仅含BMP-2、BMP-9组的含量降低，但依旧高于对照组及TNF-α组（P＜0.05）4.实时定量PCR结果：与对照组相比，成骨晚期相关指标OCN的mRNA表达量，在按实验分组加入不

8、同浓度的TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨诱导液培养21天后，仅含TNF-