胆盐输出泵在胆道梗阻再通大鼠肝组织中的表达及意义.doc

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胆盐输出泵在胆道梗阻再通大鼠肝组织中的表达及意义作者：祝建勇别平陈应果冯春林唐春吴乔　【摘要】目的探讨胆盐输出泵(BSEP)在胆道梗阻再通大鼠肝组织中的表达及意义。方法将54只Wistar大鼠随机分为假手术(Sham)组、胆总管结扎(CBDL)组、胆道再通(BR)组，测定各时相点血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆汁酸(TBA)以及肿瘤坏死因子(TNFα)的水平，采用RTPCR方法和二步法免疫组化染色分别在基因转录、蛋白表达及肝细胞膜定位上检测BSEP在大鼠肝组织中的表达情况，运用Mias99病理图像分析系统半定量检测BSEP的平均积分光密度(IOD)，与TBA和TNFα作相关分析。结果CBDL术后大鼠血清ALT，TBA及TNFα显著增高(P<0.05)；BR术后上述指标逐步好转，7d时仍显著高于Sham组水平(P<0.05)。BSEPmRNA水平随着梗阻时间的延长明显降低(P<0.05)，CBDL术后14d仅微弱表达，梗阻解除后缓慢增高；BR术后7d仍未恢复至Sham组水平。免疫组化染色显示BSEP表达定位于肝细胞膜上，变化规律与前述一致，并且与TBA和TNFα呈显著负相关(r1=-0.9257，r2=-0.8536，P<0.05)。结论胆道梗阻再通大鼠模型中胆盐的代谢与BSEP水平密切相关，而TNFα可能是影响BSEP变化的重要因素。【关键词】胆盐输出泵肿瘤坏死因子α胆道梗阻再通肝组织大鼠【Abstract】ObjectiveToexploretheroleofbilesaltexportpump(BSEP)inratliverwithbileductobstructionandbilereflow.MethodsFiftyfourmaleWistarratswererandomizedlydividedintothreegroups,shamgroup,commonbileductligation(CBDL)groupandbilereflow(BR)grouptodetectlevelofserumALT,totalbileacids(TBA)andtumornecrosisfactorα(TNFα)ateverytimepoint.ExpressionofBSEPatlevelofgenetranscription,proteinexpressionandhepaticcellmembranelocalizationwasmeasuredbyusingRTPCRandimmunohistochemistrymethod.MeanBSEPIODwasdetectedsemiquantitativelybyusingMias99pathologicalimageanalysissystem.Meanwhile,correlationofBSEPIODwithserumTBAandTNFαwasperformed.ResultsAfterCBDL,levelsofserumALT,TBAandTNFαwereascendedsignificantly(P<0.05),whichgotagraduallyfavourableturnbutwasstillhigherthanthatinshamgroupsevendaysafterbilereflow(P<0.05).TheexpressionofBSEPmRNAdecreasedasbileductobstructionelongated(P<0.05),increasedslowly14daysafterCBDLandposteriortoobstructionreliefbutdidnotreachlevelofshamgroupsevendaysafterBR.Immunohistochemistryresultsshowedasimilartendencytoabovementionedchange,ie,expressionofBSEPwas5 restrictivelylocatedonthehepatocytemembrane,whichwasnegativelycorrelatedwithTBAandTNFα(r1=-0.9257，r2=-0.8536，P<0.05).ConclusionBSEPmayberesponsibleforbilesaltmetabolisminratmodelofbileductobstructionandbilereflow,andTNFαplaysanimportantroleinregulatingBSEPexpression.【Keywords】Bilesaltexportpump;Tumornecrosisfactorα;Biliarytractobstruction;Recanalization;Livercells;Rats胆酸(盐)是肝脏分泌到胆汁中最大量的有机酸，是胆汁的主要成分。胆道梗阻时高胆酸(盐)血症一方面会导致氧自由基的产生和脂质过氧化物增加，损害生物膜功能，导致线粒体呼吸链功能障碍和氧化磷酸化紊乱；另一方面会引发肠道细菌移位和内毒素血症，进一步诱导机体免疫抑制、胃肠道黏膜损伤甚至急性肾功能衰竭，从而形成恶性循环［1］。临床上部分重度淤胆患者在胆道梗阻解除后黄疸消退仍缓慢甚至发生严重并发症。胆盐输出泵(bilesaltexportpump，BSEP)是位于肝细胞膜上介导其底物依赖ATP自细胞内转运至毛细胆管的一种膜糖蛋白，而胆酸(盐)是其合适底物［2］。本研究观察BSEP在胆道梗阻及再通大鼠肝组织中的表达变化，探讨其在胆酸(盐)代谢中的作用。1材料与方法1.1动物模型建立［3］健康雄性Wistar大鼠54只，体重200～250g，由重庆中医药研究所动物中心提供，标准饲料喂养。将其随机分为3组：假手术(Sham)组、胆总管结扎(commonbileductligation，CBDL)组和胆道再通(bilereflow，BR)组。前两组分设术后3、7和14d3个时相点；BR组设胆总管结扎14d胆道再通术后1、3和7d3个时相点，每个时相点6只。术前禁食12h，自由饮水，乙醚吸入麻醉，消毒后取上腹正中切口入腹，游离胆总管30丝线双重结扎并切断，关腹。14d后再次开腹，以直径为1.5mm的硅胶管架桥行胆总管十二指肠内引流术。Sham组只游离出胆总管，不结扎。1.2标本制备各时相点大鼠均于后腔静脉穿刺取血4～5ml，冰浴，离心15min(4℃，3000r/min)，取上清液置于-70℃保存待测；同时经门静脉灌注生理盐水冲去血液，取肝组织切成约1.0cm×0.5cm×0.5cm大小，分别置入4%多聚甲醛中待病理切片和液氮中待总RNA提取。1.3检测指标及方法(1)血清学指标的检测：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆汁酸(TBA)以及肿瘤坏死因子(TNFα)分别按照试剂盒说明在紫外分光光度计和自动γ计数器上测定。5 (2)逆转录PCR检测BSEPmRNA水平：①采用Tripure试剂一步法提取肝组织匀浆总RNA，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测定纯度并定量；②逆转录扩增按RTPCR试剂盒(美国Promega生物技术有限公司生产)说明书在GeneAmp2700PCR仪(美国PerkinElmer有限责任公司生产)中进行，自行设计BSEP引物序列：上游为5'CAACGCATTGCTATTGCTCG3'，下游为5'GTTCTGGATGGTGGACAAACG3'，内参照βactin引物序列：上游为5'ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3'，下游为5'CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3'，预计扩增产物大小分别为174bp和300bp；③将RNA逆转录为cDNA，42℃温育1h，95℃变性10min；④PCR扩增，94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸40s，循环35次，最后72℃延伸5min；⑤取6μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳成像(法国Vilber全自动凝胶成像系统)。(3)BSEP在大鼠肝组织中的表达检测：采用二步法免疫组化染色(PowerVisionTwoStepPV6001，北京中杉金桥生物技术有限公司产品)，一抗和二抗的工作浓度分别为1∶200和1∶100，运用Mias99病理图像分析系统(四川大学图形图像研究所)测量荧光的平均积分光密度(integrationopticdensity，IOD)。每张切片随机选取5个视野，每个视野测定30个阳性染色的肝细胞(阳性细胞为呈红色的阳性反应产物)，取其均值。1.4统计学分析计量数据均以±s表示，采用SPSS10.0双因素方差分析进行两组均数的比较。2结果2.1血清学指标的变化CBDL术后大鼠血清ALT和TBA显著增高(P<0.01)，BR术后上述指标逐步好转，至术后7d接近Sham组水平，差异有统计学意义(P<0.05)；TNFα浓度在CBDL术后增高，随梗阻时间的延长改变线明显，与Sham组比较差异有统计学意义(P<0.01)，BR术后TNFα逐渐下降，7d时仍显著高于Sham组水平(P<0.05)。见表1。2.2BSEPmRNA表达变化紫外分光光度计检测肝组织匀浆总RNA的A260/A280=1.92>1.8，含量为98ng/μl，说明提取的RNA较纯，无蛋白质或异硫氰酸胍的污染。经甲醛变性凝胶电泳检测，可见清晰的18SrRNA和28SrRNA两条带。BSEPmRNA经逆转录和PCR扩增，扩增产物大小为174bp。CBDL术后BSEP基因转录水平迅速下降，3d时差异有统计学意义(P<0.05)，14d时仅微弱表达，在梗阻解除后BSEPmRNA转录表达逐渐恢复，但较缓慢，7d时仍处于较低水平。见图1。2.3BSEP在大鼠肝组织中的表达变化5 免疫组化染色结果显示BSEP特异性定位于肝细胞膜上，Sham组大鼠肝组织BSEP强表达，呈线条形勾勒出细胞轮廓(图2A)，CBDL组术后BSEP染色逐渐减弱，线条特征性改变(图2B、C)，术后14d仅见微弱的特异性染色，在小叶间隔的结缔组织中和血管壁上均无染色，BR术后BSEP表达缓慢恢复，术后7d仍未恢复至Sham组水平(图2D)。肝组织BSEP表达半定量检测采用Mias99病理图像系统分析，以平均积分光密度(IOD)表示。见图1。2.4肝组织BSEP表达与TBA和TNFα的相关性检验肝组织BSEP表达与血清TBA水平存在负相关，r1=-0.9257(P<0.05)，与血清TNFα水平存在负相关，r2=-0.8536(P<0.05)。表1胆道梗阻再通大鼠血清学指标及肝组织BSEP表达的变化3讨论胆盐输出泵BSEP是位于肝细胞膜上负责将细胞内胆盐泵入毛细胆管的主要转运子［2］。Vos等［4］在内毒素等诱导的肝内淤胆大鼠模型中研究发现BSEP基因的转录及蛋白表达水平明显下降。在先天性遗传病中亦发现，Ⅱ型进行性家族性肝内胆汁淤积症(progressivefamilialintrahepaticcholestasis，PFICⅡ)是由于BSEP基因变异引起这类患者肝脏中毛细胆管的BSEP缺陷甚至完全缺失，以致胆盐难以跨越极大的浓度梯度而排入毛细胆管［5］。本研究在此基础上探讨了胆盐转运子BSEP在胆道梗阻再通大鼠肝脏中表达的时相变化以及在胆盐代谢中的作用。研究显示，在胆总管结扎的外科性胆汁淤积模型中BSEP基因的转录和蛋白表达迅速下降，CBDL术后14d的蛋白表达半定量仅为Sham组的1/5，TBA也急剧升高。在胆道梗阻解除后，BSEP表达呈现缓慢恢复的趋势，在术后7d仍未恢复至Sham组水平，TBA逐渐降低，但术后7d亦未恢复至Sham组水平。通过相关分析我们发现，肝组织BSEP表达与TBA水平存在负相关(P<0.05)。目前认为，恢复缓慢与多种因素有关，如营养状况、细胞因子、术前的黄疸程度以及术后的利胆措施等，其中细胞因子TNFα可能在这一过程中起到至关重要的作用［6］。研究发现，TNFα浓度随梗阻时间的延长显著增高，BR术后随着TNFα水平的下降，BSEP转运子在基因转录和蛋白表达水平上均有增加，在肝细胞膜上的特异性染色增强，胆盐转运的功能逐渐恢复。相关分析证实了血清TNFα水平与BSEP蛋白表达存在显著负相关(P<0.05)。我们之前的研究亦发现，生长激素能通过降低TNFα水平保护受损的肝细胞，在一定程度上维持肝细胞膜上转运子的功能，提高梗阻性黄疸大鼠的手术耐受力，并促进术后的恢复［7-8］。同时我们推测，部分淤胆大鼠在胆道梗阻解除后黄疸消退缓慢可能由于BSEP转运蛋白水平的持续低下。【参考文献】［1］AnwerMS.Cellularregulationofhepaticbileacidtransportinhealthandcholestasis［J］.Hepatology,2004,39(3):581-590.5 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