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时间:2018-09-01
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1、HLA-DQB1等位基因与广东汉族人群系统性红斑狼疮相关性研究【摘要】应用微量序列特异性引物聚合酶链反应技术(Micro-PCR-SSP),探讨我国广东籍汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)与HLA-DQB1基因的相关性。对38例SLE患者和110例正常对照者的血样进行分析,实验表明,SLE患者DQB1*0601等位基因频率显著升高(RR=2.19,P=0.0055),可能是易感基因,而DQB1*0301与DQB1*0401基因频率则显著降低(DQB1*0301,RR=0.1253,P=0.0001;DQB1*0401,RR=0,P=0.0409),可能为保护基因。 【关键词
2、】HLA-DQB1等位基因;系统性红班狼疮 系统性红斑狼疮(SLE)发病机制极为复杂,常累及多个脏器,发病有一定的遗传倾向。人类白细胞抗原系统(humanleukocyteantigens,HLA)是一组组成和结构都有非常复杂的基因复合体,HLA最主要的特点是具有高度多态性,特别是在HLA-Ⅱ类基因的第二外显子区,这种多态性更为明显。与SLE有关的主要是HLA-Ⅱ类基因[1],HLA-Ⅱ类基因座在HLA-D区,包括HLA-DQ、DR、DP三个亚区,已知HLA-DQ的多态性与SLE自身抗体的产生关系最密切[2]。本中心实验室应用微量序列特异性引物聚合酶链反应技术(Mic
3、ro-PCR-SSP)从分子遗传学角度,探讨HLA-DQB1与广东汉族人SLE患者的遗传易感性关系。 1材料和方法 1.1研究对象拟选广东籍汉族SLE患者38例,SLE患者均符合1992年美国风湿病协会修订的诊断标准。选取连续三代均为广东籍无亲缘关系的健康者100例作为对照组,与患者无血缘关系。 1.2标本采集抽取SLE患者与正常人静脉血各2ml,ACD-B抗凝。 1.3试剂 1.3.1引物设计按文献[3]合成28条核苷酸链,组成20对引物。 1.3.2Taq酶购自上海生工生物工程技术有限公司。 1.3.3DNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。
4、 1.4基因组DNA的制备取2mlACD-B抗凝全血3000转/min,离心10min,吸取200μl白膜层加入1.5ml离心管中,加入25μlQIAGEN蛋白酶K和200μlAL缓冲液,混匀15s,70℃孵育10min,然后加入200μl无水乙醇混匀,将上述混合液转至DNA亲和柱上,离心10000转/min1min,去除滤过液,在柱上加入500μlAW1缓冲液,离心1min,再加入AW2缓冲液,重复洗涤一次,然后加入200μl的AE缓冲液,室温孵育5min,最后离心1min洗脱DNA,并测定DNA的浓度和纯度。 1.5DNA扩增在SSP-PCR反应体系中,每一DNA
5、均作20支反应管,每管反应液50μl,含25μmol/LdNTP,10×PCR缓冲液1.5μl,MgCL21.5mmol/L,Taq酶1U,模板DNA50~100ng,等位基因专一性引物各0.25μmol/L。PCR循环参数为95℃1min预变性,然后94℃30s、60℃30s、72℃60s,35个循环,最后72℃延伸5min。扩增结束后,将扩增产物转至2%琼脂糖凝胶微量胶内,125伏电压电泳15min,然后在凝胶一次性成像仪上观察并拍照。 1.6统计学分析2用直接计数法计算基因频率。用Fisher精确法统计P值和相对危险度(RR)。显著检验水平为0.05。
6、2结果 从表中可以看出,与正常对照组相比,SLE患者组中DQB1*0601等位基因频率显著升高(RR=2.19,P=0.0055),而DQB1*0301与DQB1*0401基因频率则显著降低(DQB1*0301,RR=0.1253,P=0.0001;DQB1*0401,RR=0,P=0.0409)。 3讨论 人类主要组织相容性复合体(MHC)含128个功能基因,其中39.8%的基因和免疫系统有关,因此39.8%基因可能与许多免疫疾病的发生直接或者间接相关[4]。近年来国外的许多研究资料表明,在遗传因素方面,SLE与HLA基因的遗传易感性关系存在着种族和人群差异的影
7、响,尤其DQ位点的作用引人注目。笔者通过应用PCR-SSP技术获得了广东正常人群和SLE患者基因频率,结果发现SLE患者DQB1*0601等位基因频率较正常人显著升高,提示DQB1*0601可能是SLE的易感基因,而正常人DQB1*0301与DQB1*0401的等位基因频率显著升高。在高加索人种的SLE患者中,HLA-DQB1易感基因可能是DQB1*0602,*0602和*0301;保护基因可能是DQB1*0501;在日本SLE患者中,易感基因可能是DQB1*0602。这些研究结果与笔者对广东SLE患者
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