人子宫蜕膜树突状细胞 DEC-205+HLA-DR+CD11c+的分离纯化与鉴定.doc

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1、人子宫蜕膜树突状细胞DEC-205+HLA-DR+CD11c+的分离纯化与鉴定作者：祝文峰袁建辉曾国琼李红梅【摘要】目的：探讨人子宫蜕膜树突状细胞的分离方法和诱导培养的最佳条件，为研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用奠定基础。方法：人早孕（7~12周）子宫蜕膜组织经机械破碎，梯度离心获得蜕膜低密度细胞，经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）诱导，所获得细胞用FITC标记的抗人DEC-205、HLA-DR、CDllc抗体进行鉴定。结果：从蜕膜组织可获取足够数量蜕膜树突状细

2、胞，体外培养10~18d细胞生长较为活跃，第14天左右达到最高值，维持3~4d开始下降，20d内细胞数仍能维持在（1.0~2.3）×105个/mL。结论：梯度离心法能成功分离蜕膜树突状前体细胞，GM-CSF和SCF体外诱导可提供蜕膜树突状细胞原代培养较为满意的生长条件。【关键词】妊娠；免疫耐受；蜕膜；树突状细胞；分离和纯化〔Abstract〕ObjectiveToinvestigatetheseparationmethodsandgrowthconditionsofdecidualdendrit

3、iccells,andestablishthegroundworkfortheresearchofdendriticcell'sfunctionarymechanisminmaternalimmunityandtolerancetothefetus.MethodsThefreshearlygestation(7~12wkgestation)decidualtissuewasdispersedmechanicallyinHank'Sbalancedsaltsolution,andthelowden

4、sitycellswereobtainedbygradientcentrifugationandculturedwithgranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)andstemcellfactor(SCF).Thenthegeneratedcellswereidentifiedbyphenotypicandfunctionalmethods.ResultsAtotalof1.0~2.3×105decidualdendriticcel

5、lswereobtainedfromthefreshdecidualtissue.Thesecellsgrewvigorouslywithin10~18daysandreachedthepeakatthe14thday.ConclusionThemethodofechanically,gradientcentrifugationcansuccessfullyseparatethedecidualdendriticcells.GM-CSFandSCFcanpromotethegrowthofthe

6、decidualdendriticcellsandprovidesatisfactorygrowthconditionsforthem.〔KeyWords〕Gestation;Immunityandtolerance;Deciduas;Dendriticcells;Separationandpurification　　正常妊娠有赖于母体和胎儿间的免疫平衡。正常妊娠时，母体免疫系统以Th24型免疫应答为主，保护胚胎乃至胎儿胎盘不被母体排斥，维持母体对胎儿的免疫耐受。研究表明[1]，树突细胞对母体免

7、疫耐受的启动起着重要作用，发现早孕期蜕膜中存在HLA-DR+lin-的树突细胞，并认DEC-205+可作为蜕膜树突状细胞的标志。本研究采用密度梯度离心法成功分离了人早孕子宫蜕膜树突状细胞，并用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）诱导其大量生长，为后续研究树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用奠定了基础。1材料和方法1.1材料人早孕（7~12周）子宫蜕膜组织（本院门诊要求终止妊娠的组织标本）。D-Hanks'（平衡盐溶液），配制方法见文献[2]，高压灭菌备用；细胞分离液：3%F

8、icoll（菲科尔）/10%泛影葡铵；RPMI1640（细胞培养液，Sigma公司），使用前加入青霉素、链霉素（100U/mL、100U/mL）、10%小牛血清；50g/LGM-CSF（粒-巨噬细胞集落刺激因子，华美公司）；20g/L干细胞因子（SCF，华美公司）。抗人DEC-205、HLA-DR和CD11c（1:200，博士德公司）。1.2方法1.2.1蜕膜树突状细胞分离和培养无菌切除的新鲜蜕膜组织用D-Hanks'液冲洗2次，置入消毒后的组织匀浆器中，加入D-Hanks'l0mL制成匀浆，2