小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的分离培养、纯化和鉴定

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2、下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：罐b豸k剔稚毫鼋矛』f；年多月二6目目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO研究论文小鼠骨髓源未成熟树突状细胞分离培养、纯化和鉴定前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11刖吾⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯””“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯+11材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··25结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30综述未成熟树突状细胞与多发性硬化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33致葫j．⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯一45个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46中文摘要小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的分离培养、纯化和鉴定摘要目的：树突状细胞(dendriticcell，DC)是迄今发现惟一能刺激初始T细胞活化增殖的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，也是体内最主要的抗原递呈细胞。既往认为DC是特异性免疫应答的启动者，但近年来研究发现DC在免疫调节中发挥免疫应答和免疫耐受的双重作用。根据成熟程度，将DC分为未成熟DC(immatureDC

5、，imOC)和成熟DC(matureDC，mOC)。mDC可以激活T淋巴细胞诱导免疫应答，而imDC不能活化T淋巴细胞，但具有较强的抗原摄取及处理能力。最近的研究表明imDC可诱导免疫耐受，其机制有清除T细胞、诱导T细胞免疫无能和诱导调节性T细胞的产生。基于imDC的特性，近年来将imDC用于T细胞介导的自身免疫性疾病的研究越来越得到重视。因此，能够准确、高效的分离培养出imDC并对其进行鉴定是运用imDC开展下游实验的前提与基础。本研究旨在用rmGM．CSF、rmlL一4体外诱生小鼠骨髓源未成熟树突状细胞，并运

6、用免疫磁珠分离的方法纯化所获得的imDC，并从形态学、细胞表面分子的表达及对同种异基因T细胞的刺激增值能力三个方面对imDC进行鉴定，对小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的体外分离培养、纯化和鉴定方法进行探讨和改良。方法：1小鼠骨髓源性未成熟DC的体外诱导及培养用拉颈法处死C57／B6小鼠，用75％乙醇与碘伏消毒后，无菌条件下取出下肢骨并去除周围组织，在长骨两端打孔使骨髓腔联通并暴露骨髓，用适量RPMI．1640培养液冲出骨髓，使用200目滤网过滤杂质并收集细胞后加入红细胞裂解液。裂解红细胞完毕后用RPMI-1640培养

7、液洗涤细胞，然后用细胞培养液(含10％胎牛血清、RPMI一1640、rmGM-CSF(10ng／m1)、rmlL．4(10ng／m1))调整细胞浓度到106，m1。6孔培养板中每孔加入4ml上述液体，将培养板放入37。C、含50／乞c02的培养箱中培养，于第48小时更换培养液，于第96小时补充培养液，至第5天收集所有悬中文摘要浮细胞，用所得细胞进行下一步实验。2分离纯化imDC计数后将imDC重悬于缓冲液中并加入CDllc免疫磁珠，于40C冰箱内孵育15分钟后重悬。利用磁珠分选器分选，将磁珠标记的细胞悬液置入分选

8、柱中，收集流出物，此为未标记的阴性细胞。然后收集分选柱中的CDllc+细胞，此即为纯化后的imDC。3小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的鉴定3．1细胞形态学观察在倒置荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜下对imDC进行观察。3．2流式细胞术检测细胞表面分子将培养板中的悬浮细胞收集至离心管中，做流式细胞检测前处理并加入抗体孵育。检测imDC表面MHC．II、CDllc、CD80、CD8