Wnt信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化.doc

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1、Wnt信号途径在胃癌组织和细胞系中的活化作者：韩竞春，黄磊，张开立，陈晓燕，孔庆友，孙媛，吴茉莉，李宏【摘要】目的研究Wnt通路在胃癌组织中的活化状态及其与胃癌发生发展的关系。方法应用免疫组化、免疫荧光、RTPCR和Western蛋白印迹等方法，在胃癌组织和细胞系中检测Wnt信号途径的活化状态。结果Wnt2、βcatenin和TCF4在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织（P<0.01）；Wnt组与Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异（P<0.001）。结论Wnt信号通路在胃癌组织中呈活化状态

2、，并与胃癌发生发展密切相关。【关键词】胃肿瘤；Wnt；信号传导　　Abstract：ObjectiveToillustratetheactivationstatusofWntsignalinganditscorrelationwithgastriccarcinogenesis.MethodsImmunohistochemistry,immunofluorescence,RTPCRandwesternblottingwereadoptedtodetectWntsignalingactivationinthegastriccan

3、certissuesandcelllines.ResultsExpressionsofWnt2,βcateninandTCF4weresignificantlyhigherinthecancertissues,comparedwithpremalignanttissues(P<0.01).ThedistributionsofWnt+andWnt-groupsweresignificantlydifferentinpremalignantandcanceroustissues(P<0.001).Conclusion

4、Wntsignalingisnotonlyactivatedingastriccancertissuesbutassociatedwithgastriccarcinogenesisaswell.　　Keywords：gastricneoplasm;Wnt;signaling　　胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室与澳大利亚墨尔本大学癌症研究中心合作，利用基因芯片杂交技术[1]，对胃癌及其相关性病变的基因表达谱进行研究发现，在胃癌的发展过程中出现了Wnt信号的异常，包

5、括Wnt表达的频率上调[2]，以及TCF4和βcatenin的核易位[3]。本研究针对胃癌组织中Wnt传导通路关键基因及总体水平的活化状态进行探讨。　　1材料与方法　　1.1材料（1）标本来源和细胞系来源：54例胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室建立的人胃癌组织库。胃癌细胞系AGS和HGC27购于美国ATCC（AmericanTypeCell5Culture）细胞库。MGC803（人胃低分化黏液癌）和BGC823（人胃低分化癌）从北京肿瘤研究所购进。（2）抗体：羊多克隆Wnt2抗体，鼠单克隆βc

6、atenin抗体，兔多克隆TCF4抗体，免疫荧光羊抗鼠抗体，免疫荧光羊抗兔抗体均为SantaCruz（SantaCruz，CA，USA）公司产品。　　1.2方法（1）石蜡组织微阵列的制作：石蜡组织微阵列采用自制的阵列制作仪制作。（2）免疫组化染色：免疫组化试剂盒：HistostainTMplusKitsSP9003(山羊SPKit)、SP9000（通用SPKit）购自北京中山生物技术有限公司；按照SP试剂盒说明进行免疫组化染色。结果的判定按参考文献[4]。（3）细胞培养：①MGC803和BGC823细胞培养液：DMEM培

7、养基，10%胎牛血清。②AGS及HGC27细胞培养液：Ham’sF12培养液，10%胎牛血清，根据美国ATCC推荐[5～6]。在细胞培养箱中培养细胞至80%汇合时收集细胞，提取RNA和蛋白用于实验分析。（4）RNA提取和RTPCR分析：常规Trizol法提取总RNA。反转录体系依照TaKaRaRNALAPCRTMKit试剂盒提供说明书进行操作，PCR引物序列（TaKaRa生物工程有限公司）见参考文献[7～10]。（5）胃癌细胞系总蛋白的提取及Western印迹分析：常规提取细胞总蛋白。Western印迹分析参照文献[11

8、]方法进行。（6）免疫荧光：预先在培养皿底铺数张已灭菌的盖玻片（约5mm×5mm），把细胞接种于皿中，等细胞均匀生长在皿底和盖玻片上时，取出盖玻片，100%冷丙酮-20℃固定，用于免疫荧光分析。βcatenin和TCF4在细胞系中表达采用双色荧光标记法。　　1.3统计学方法