Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系.doc

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1、Desmin基因exon6A360P错义突变与克山病的关系作者：张洁　刘作功　郭雄　赖江华【摘要】　　目的探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法采用临床流行病学方法调查，随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样，提取基因组DNA，采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病

2、心肌损伤的易感基因突变。【关键词】克山病；Desmin基因；易感基因；　　克山病与扩张性心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)的主要病理变化均为心肌的变性、坏死、纤维化(替代瘢痕)，最终导致心脏功能失代偿[1]，两病在心肌病理学变化、临床症状体征上均缺乏特异性的鉴别诊断指标[2]。近年来已发现一些与DCM相关的基因突变，如细胞骨架蛋白基因(desmin、dystrophin、laminA/C、δsarcoglycon、Metavinculin等)和心肌肌小节成分蛋白基因(Actin、atropomyosin、Troponin

3、T、βMHC、Titin、cMyBPC、MLP等)[34]。国内报道[5]克山病患者心肌组织中Desmin荧光染色明显异常，离病灶越近Desmin改变越明显，且与病程成正相关，以慢型克山病多见。已知desmin基因的多个突变中，exon6错义突变与DCM相关性较大，但与慢型和潜在型克山病的关系仍不明确。为此，本调查采用PCR和凝胶电泳的方法检测慢型和潜在型克山病患者中是否存在与DCM患者相同的desmin基因exon6错义突变，以寻找可能的鉴别诊断指标。　　1材料与方法　　1.1调查对象与分组选取陕西省黄陵县店头镇各乡296例、非克山病病区西安市长

4、安区30例为调查对象，依据中国《克山病诊断标准》(标准编号：GB1702121997)，检出慢型和潜在型克山病患者82例，临床表现主要有心律失常、多发性室早、房颤等，其中慢型克山病患者占4.7%(14例)，潜在型患者占23.0%(68例)。随机抽取克山病患者组30例(病例组)，病区内正常对照组30例(内对照组)。非病区正常对照组30例(外对照组)。方差分析病例组与其他两组年龄和性别没有显著性差异。　　1.2样品采集与处理使用含知情同意书的统一调查表进行调查后，采集肘静脉血5mL，EDTA抗凝，冰块保存运输，置-25℃冰箱低温保存。　　1.3实验方法4　　

5、1.3.1外周血DNA的制备血样采用盐析法制备DNA，用于做PCR扩增和基因突变的酶切分析。　　1.3.2Desmin基因突变位点与引物序列选择Desmin的基因组DNA全长11990bp，有9个外显子，其中exon6的突变类型为A360P位点错义突变，exon6上、下游引物序列来源于文献[6]，分别为5′CCTCTCCTGCAGAACGATTC3′；5′TCCTGCCTGGCCCCTCAC3′。含exon6的片断长度为250bp，如果在基因组DNA的6211位点发生A360P错义突变，则用内切酶Bsp1286I可将该片断切开为两个分别为184b

6、p和66bp的片断[7]。为保证实验体系及内切酶的有效性，特设定内对照。选择内切酶Bsp1286I，将desmin基因序列输入相应软件中，可看到酶切位点在5407，而5407位点位于exon4片段内，故用PCR扩增exon4片段，可被Bsp1286I切为长度分别为60bp、122bp两个片断。Exon4的引物来源于文献[7]，序列为5′AAGCCCAGTCATGCCCTACA3′，5′CTTCGACTTGTACCACTCCTCAGC3′。　　1.3.3Desmin基因PCR扩增步骤标准的PCR反应体系：20μL模板DNA为200ng基因组DNA，

7、TrisHCL(pH8.4)20mmol/L、KCl50mmol/L、MgCl21.5mmol/L、dNTP各50μmol/L，正反义引物各0.2μmol/L，TaqDNA聚合酶2.5u。PCR反应条件：94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，循环30次。对PCR扩增的基因片断exon6及内对照exon4选用限制性内切酶Bsp1286I进行酶切。　　1.3.4琼脂糖凝胶电泳及银染配制1.5g/L琼脂糖用于电泳，50V电压，电泳20-40min。　　1.3.5分析、比较各组酶切图谱。　　2结果　　2.1exon4酶

8、切位点分析Bsp1286I将内对照exon4片段酶切为60bp和122bp两个条