蛋白酶酶活的测定方法(福林法)

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1、蛋白酶酶活的测定方法(福林法)1.酶单位定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位,以u/g(u/mL)表示。2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下,水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝和钨蓝,用分光光度法测定,计算其酶活力。3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g,水700m

2、L、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL,小火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(LiSO4)50g,水50mL和数滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷却后仍有绿色需要再加入溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却,加水定容至1000mL,混匀,过滤。制得得试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀。3.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.3三氯乙酸c(CCl3.COOH)=0.

3、4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。3.5盐酸溶液c(HCl)=1mol/L及0.1mol/L按GB601配制。3.6缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5),适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。b.乳酸缓冲液(pH=3.0),适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000mL。乙

4、液称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL,乙液1mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。c.硼酸缓冲溶液(pH=10.5),适用于碱性蛋白酶。甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL,乙液400mL,混匀,用水稀释至1000mL。3.710g/l酪素溶液称取酪素10.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)

5、湿润后,加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入1000mL容量瓶,用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。3.8100μg/mLL-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,准确至0.0002g,用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/l盐酸定容至100mL,即得100μg/mLL-酪氨酸标准溶液。4

6、仪器和设备4.1恒温水浴40℃±0.2℃。4.2分光光度计应符合GB9721的规定。5分析步骤5.1标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制。表A3管号酪氨酸标准溶液的浓度μg/mL取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验),各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL,福林试剂使用液1.00mL,置于40℃±0.2℃水浴中显色20min,用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿,以不含酪氨酸的

7、0管为空白,分别测定其吸光度,以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度C为横坐标,绘制标准曲线(曲线应通过零点)。根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),既为吸光度常数K值。其K值应在95~100范围内。5.2测定(1)待测酶液的制备a.称取酶粉1~2g,精确至0.0002g(或取液体酶1.00mL),用少量该酶的缓冲液溶解,并用玻璃棒搅拌捣研,将上清液小心倾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀。通过四层纱布过滤,滤液根据酶活力再用一次缓冲液

8、稀释至适当浓度,供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25~0.40范围内)。b.酶粉测定时,稀释倍数参考表4(液体酶液可参照表4稀释)。表4酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释2万20002g—200mL(100倍)5mL—100mL(20倍)3万25002g—500mL(250倍)5mL—

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