蛋白酶测定方法

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1、蛋白酶活性测定方法一蛋白酶活力单位定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。二测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。三应用范围本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。四测定条件4.1底物：酪蛋白4.2pH：3.004.3温度：40℃±0.5℃4.4保温时间：10min五仪器5.1紫外分光光度计5.2超级恒温水浴40±0.2℃5.3秒表5.4

2、分析天平：感量0.0001g六试剂和溶液6.1.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL。6.1.3三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。6.1.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。6.1.5盐酸溶液c(HCl)=1mol/L及0.1mol/L按GB601配制。6.1.6缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20

3、)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b.乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。c.硼酸缓冲溶液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL,上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。6.

4、1.7l0g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注:3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。6.1.8l00μg/mLL-酪氨酸4)标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。注:4)

5、L-酪氨酸采用上侮长江生化制药厂产品。b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.lmol/L盐酸定容至100mL，即得到100μg/mLL-酪氨酸标准溶液。七分析步骤7.1标准曲线的绘制（求K值）按下表1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K值，(其K值应在130～135范围内)。管号取100μg/mL酪氨酸标准溶液体积mL取水体积mL酪氨酸标准溶液浓度μg/mL0010011910228203373044640555507.2待测酶液的制备称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00mL)，用少量该酶的缓

6、冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)测定酶粉时稀释倍数参考下表(液体酶亦可参照下表稀释)。酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释2～5万20001g→200mL(200倍)10mL→100mL(10倍)8～10万40001g→200mL(200倍)5mL→100mL(20倍)7.3测定测定操作按下列所示反应顺序样品管空白管1．加入待测酶液2.0mL2.0mL

7、2．（预热2分钟）√√3．反应底物预热3分钟√√4．加入底物溶液2.0mL2.0mL(第二步)5．混匀√√6．40℃水解10min√√7．加入三氯乙酸终止液4.0mL4.0mL(第一步)8．混匀√√9．静止10分钟√√10.过滤√√总体积8.0mL8.0mL滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度(A)。7.4计算X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E/m式中：X——样品的酶活力，u/g(u