人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建.doc

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1、人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建作者：朱清顾云，陆伟，刘梅【摘要】目的：对人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）进行基因突变，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，并在大肠杆菌中诱导表达。方法：选择大肠杆菌偏爱密码子，将hGLP-1（7～37）第2位的丙氨酸（Ala8）定点突变为缬氨酸（Val8），直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接，形成完整的hGLP-1突变体基因（Val8）hGLP-1，并连接到载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21，BamHI与XhoI双酶切电泳鉴定与序列测定，然后诱导表达其融合蛋白。

2、结果：经酶切电泳鉴定与测序分析，证实所合成的突变体基因（Val8）hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中，经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础，为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。【关键词】人胰高血糖素样肽-1；融合蛋白；基因突变；克隆；糖尿病ConstructionofexpressionvectorofhumanGlucagon-likepeptide-1mutantgene[Abstract]Objective:To

3、obtainthemutantgeneofhumanGlucagon-likepeptide-1(hGLP-1),constructtheexpressionvectorofpGEX-4T/（Val8）hGLP-1,andexpresstheGSTfusionproteininE.colicells.Methods:WiththepreferentialcodonofE.colibeingselected,fouroligonucleotidefragmentsweredirectlybiosynthesized,thenweresplicedtoformacomple

4、temutantgeneofhGLP-1whichchangedthecodonforthesecondaminoacidofhGLP-1(7~37)-alanine(Ala8)intovaline(Val8)bymeansofsite-directedmutagenesis,soitnamed（Val8）hGLP-1.ThemutantgenewasinsertedintothevectorpGEX-4T-1withBamHIandXhoIrestrictionsites.TherecombinantplasmidofpGEX-4T/（Val8）hGLP-1wastr

5、ansformedintoE.colicells(BL21),thenidentifiedbyelectrophoresisafterenzymedigestionandtestifiedbyDNAsequencing,furtherinducedtoexpressthefusionproteinbyIPTG.Results:TheresultsofelectrophoreticanalysisandDNAsequencingconfirmedthatthesyntheticmutantgene(Val8)hGLP-1hadbeenclonedintothepGEX-4

6、T-1successfully,andinducedexpressionoffusionproteinbySDS-PAGEanalysis.Conclusion:TheGSTfusionproteinexpressionplasmidofpGEX-4T/(Val8)hGLP-1wassuccessfullyconstructed，whichlaidthefoundationforfurtherobtainingrecombinanthGLP-1mutantforexperimentalorclinicalstudiesandprovidedthe6technicalro

7、utesofindustrialization.[Keywords]HumanGlucagon-likepeptide-1;Fusionprotein;Genemutation;Cloning;Diabetesmellitus人胰高血糖素样肽－1（humanglucagon-likepeptide-1,hGLP-1）是由人胰高血糖素基因编码、并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，它是随着食物在肠道的消化吸收过程而分泌的，其功能由hGLP-1受体(hGLP-1R)介导，是目前能诱导胰岛素分泌的最强物质之一，还能以同样的强度抑制胰高血糖素的分泌，