人胰高血糖素样肽

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1、人胰高血糖素样肽朱清顾云，陆伟，刘梅【摘要】目的：对人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）进行基因突变，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，并在大肠杆菌中诱导表达。方法：选择大肠杆菌偏爱密码子，将hGLP-1（7～37）第2位的丙氨酸（Ala8）定点突变为缬氨酸（Val8），直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接，形成完整的hGLP-1突变体基因（Val8）hGLP-1，并连接到载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21，BamHI与XhoI双酶切电泳鉴定与序列测定，然后诱导表达其融合蛋白。结果：经酶切电泳鉴定

2、与测序分析，证实所合成的突变体基因（Val8）hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中，经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础，为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。【关键词】人胰高血糖素样肽-1；融合蛋白；基因突变；克隆；糖尿病ConstructionofexpressionvectorofhumanGlucagon-likepeptide-1mutantgene[Abstract]Objective:Too

3、btainthemutantgeneofhumanGlucagon-likepeptide-1(hGLP-1),constructtheexpressionvectorofpGEX-4T/（Val8）hGLP-1,andexpresstheGSTfusionproteininE.colicells.Methods:arker、λDNA/HindⅢMarker均为TaKaRa公司产品,T4DNA连接酶和琼脂糖为Promega公司产品，质粒抽提试剂盒为TIANGEN公司产品，预染蛋白Marker为上海Biolabs公司产品。1.2方法1.2.1hGLP-1

4、突变体cDNA序列设计与合成参照文献[6]并加以改进，以缬氨酸（Val8）取代hGLP-1N端第二位丙氨酸(Ala8)，根据其氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成待重组的含第二位点突变(Val8)密码子的（Val8）hGLP-1cDNA序列。设计合成4个寡聚核苷酸片段（F1～F4），由英骏生物技术有限公司合成，其长度分别为：F1：54nt；F2：54nt；F3：58nt；F4：50nt；合成基因总长度为112bp；包括位于5'端BamHI和3'端XhoI酶切位点；两个终止密码子TGA和TAA；在GST与（Val8）hGLP-1编码序列之间加

5、入溴化氰裂解位点蛋氨酸密码子ATG。hGLP-1突变体cDNA序列设计如下：F1：5'-GATCCATGCACGTAGAAGGTACCTTCACCT-CTGACGTATCCTCTTACCTGGAAG-3'F2:5'-GCCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGG-CTGGTTAAAGGCCGTGGTTGATAAC-3'F3:5'-AGCCTGGCCTTCCAGGTAAGAGGATACGT-CAGAGGTGAAGGTACCTTCTACGTGCATG-3'F4:5'-TCGAGTTATCAACCACGGCCTTTAACCAGC-CAAGCGAT

6、GAATTCTTTAGC-3'1.2.2目的基因（Val8）hGLP-1的获得（1）寡聚核苷酸的复性分别将合成的四个寡聚核苷酸链F1、F2、F3、F4用TE溶解。分别将等摩尔的F1与F3，F2与F4进行两两复性，并使之终浓度为1pmol/μl，复性总体系均为20μl。复性条件均为90℃5min、65℃10min后静置冷却至室温；（2）双链片段的拼接：取复性好的F1F3、F2F4双链按如下体系混合各溶液：F1F33μl,F2F43μl,2×DNA连接酶buffer10μl，T4DNA连接酶（3U/μl）2μl，ddH2O2μl，总体系20μl；37℃水浴

7、孵育3～4h。然后行2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3原核表达质粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1的构建用BamHI和XhoI对原核表达载体PGEX-4T-1进行双酶切，将目的基因与酶切好的PGEX-4T-1原核表达载体于14～16℃连接3～4h。连接产物转化BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素（Amp）选择培养后，挑取独立、分离的单克隆4～6个，分别置于内含Amp的5ml液体LB培养基中37℃振荡培养过夜。取培养好的菌液离心后回收菌体，质粒抽提试剂盒抽提质粒，用BamHI和XhoI进行双酶切，酶切产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将酶切片段长度符合

8、插入片段长度的重组质粒送上海英骏公司测序部测序鉴定。(责任编辑：admin)1.2.4重组诱导