口蹄疫疫苗制品中bhk21宿主细胞残余蛋白含量检测方法的建立

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1、口蹄疫疫苗制品中BHK21宿主细胞残余蛋白含量检测方法的建立1、BHK21细胞蛋白抗原的制备1.1BHK21细胞的悬浮培养采用疫苗生产工艺方式进行BHK21细胞的悬浮培养，控制反应器参数在正常范围内：温度37℃、PH7.2~7.4、溶氧（DO）20%~70%、搅拌转速50~150r/min（参考）1.2抗原的制备1.2.1透析袋的处理新买来的透析袋（8000、10000、25000）用沸水煮5~10min，再用蒸馏水洗净，即可使用。如洗净的透析袋长期不用要放在含有少量NaN2的蒸馏水中，放置长菌。1.2.2细胞液的浓缩将细胞液装入透析袋

2、中，置于装有2L0.01mol/LPBS的大烧杯中，放入4℃冰箱中透析过夜，每2~3h更换一次缓冲液。将透析袋取出放在洁净容器中，在透析袋上面撒上PEG6000，根据浓缩浓度确定浓缩时间。将浓缩好的样品置于-80℃进行冰冻之后拿到室温进行融化，反复几次直到细胞破碎完全。2、BHK21细胞蛋白抗血清的制备免疫血清的制备将制得的抗原蛋白溶液与等量的完全福氏佐剂进行乳化，首次免疫在兔脊柱两侧2点进行皮下注射，每点注射量为1mL，二次免疫在首次免疫两周后进行，将蛋白抗原溶液与等量的不完全福氏佐剂进行乳化，采用脊柱两侧2点注射和腿部肌肉2点注射，

3、其中每点0.5mL。之后每两周注射一次抗原，并在注射前进行采血。将注射抗原前后采集的血液进行比较，检测是否有抗体产生。待确定有抗体产生后方可大量采集血液（但每只兔子收集血液不能超过40mL，以防止其休克）。将收集到的血液置于4℃1000g离心15min，分离血清后置于-20℃保存备用。3、多克隆抗体的纯化3.1初纯将抗血清按1:3的体积与乙酸钠缓冲液（0.06mol／L，pH4.0）混合，0.1mmno/L的NaOH调整PH值到4.5，于4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前抗血清计算，使其与血清的体积比为1:25，4℃静置2

4、h，10000r/min离心30min，取上清加入1/10体积的10×PBS（4℃，0.1mol/L，PH7.4），保持在4℃环境中，30min内加入(NH4)2SO4使终浓度为0.277g/mL，静置1h以上。4℃10000r/min离心30min，弃去上清。将沉淀溶于起始抗血清1/5体积的PBS中，用100倍体积的PBS（37mmol/LNaCl，2.6mmol/LKCI，0.2mmol/LEDTA）4℃透析过夜。4℃10000r/min离心30min，除去不溶物，产物与-20℃保存。3.2亲和层析纯化3.2.1ProteinASe

5、pharoseCL-4B柱子的准备通常准备5mL或10mLProteinASepharoseCL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15min以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将ProteinASepharoseCL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1mL/min~2mL/min，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。3.2.2亲和层析将抗体用TBS缓冲溶液以1：X（X=0、2、4、9和29）的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。取

6、10mL进行上柱，流速为0.2mL/min，为保证抗血清与填料的充分结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。上柱完毕后，用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008，加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.2mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用1MTris缓冲液（PH9.5）中和，以防止抗体的变性。在柱中加入10mLpH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/mL可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后于2℃~8℃保存。用含0.05

7、%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2℃~8℃环境。、3.3SDS-PAGE检测抗体浓度分离胶和浓缩胶的制备:成份12%分离胶5%浓缩胶8mL4mLddH2O2.6mL2mL30%丙烯酰胺3.8mL670μL1.5MTris-Cl(PH8.8)2.0mL/1.0MTris-Cl(PH6.8)/500μL10%SDS80μL40μL10%AP80μL40μLTEMED4μL4μL3.3.1装板将玻璃板洗净用纱布擦干，将灌胶模具装好。3.3.2凝胶的配制按照上表配方及顺序配制分离胶，AP和TEMED主要起到促凝的作用，因此在加入

8、AP和TEMED之前先将其他成份混和均匀，然后加入AP和TEMED后快速混匀，并立刻将其灌注到两块玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间，然后在分离胶上方小心覆盖无菌水至内侧玻璃板顶端，以压平凝胶表面；待