基因克隆与突变 培训版

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1、中国生命科学实验技术服务中心威斯腾生物技术服务中心专业机构，打造专业服务！基因克隆与基因突变技术一、基因克隆(genecloning)1、基因克隆的起因：基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个

2、体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。　　基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。　　基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于197

3、2年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一s次完整地建立起了基因克隆体系。　　一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及

4、基因工程等。基因克隆的原理：习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子。实验预约热线：15008489113，QQ7742053,QQ群号码：38239484Email：sc-western@163.com网址：www.cqwestern.com中国生命科学实验技

5、术服务中心威斯腾生物技术服务中心专业机构，打造专业服务！基因定位克隆或图位克隆（map-basedcloning）是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。具体的步骤是先将目的基因，亦即目的基因的突变定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的片段克隆并分离出来；最后是根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。成功地应用基因定位技术分离目的基因的一个必要条件是，以酵母人工染色体YAC（yeastartificialch

6、romosome）为载体构建含有大片段DNA的YAC库。另一个必要的条件是要有可用的同目的的基因紧密连锁的DNA探针。酵母人工染色体（yeastartificialchromosome。YAC）载体可以数百kb的大分子量的DNA片段。YAC载体包括如下的组成部分：①一段来自酵母染色体的着丝粒序列；②一段控制酵母DNA复制的自主复制序列（autonomouslyreplicatimgsequence，ARS）；③一对酵母的端粒序列，在有的YAC载体中（例如pYAC4），这对端粒序列来自四膜（Tetrahymena）染色体；④选择记号；⑤位点。YAC载体能够如同染色体一样在酵母细胞中正常地复

7、制，并可以大片段的外DNA，其大小至少可相当于最大的酵母染色体。应用酵母人工染色体构建真核YAC库的基本过程如下：首先选用核酸内切限制酶EcoRI和BamHI对YAC载体pYAC4作双酶消化，结果两个端粒序列之间的片段便被移走，产生出具有EcoRI粘性末端的两条臂分子。在每一条臂分子中都带有一段端粒序列和一个选择记号。同时再选用一种切割位点稀少的核酸内切限制酶，对高分子量的真核DNA作局部消化。实验预约热线：15008489113，