TILLING技术及其基因突变克隆

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1、Cdle^eMTrepicalBbbgyandAgwMiny论文题目TILLING技术及其突变基因克隆作者管家伟学号12223104指导教师王沛政专业班级非师范2珂E完成日期：2015年6月18日TILLING技术及其基因突变克隆摘要：TILLING⑴(定向诱导基因组局部突变)技术是近年发展起来的一种高通量筛选化学诱变技术。是一种全新的反向遗传学研究方法，它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING的原理和技术优势，并对其在植物功能基因组学⑵、突变分子育⑶种和预测突变频率小的应用作了初

2、步探讨。关键词：TILLING；点突变；植物功能基因组学；突变分了育种；克隆1TILLING技术介绍1.1TILLING技术基本原理通过化学诱变产生一系列的点突变，经PCR扩增放人，经过变性复性过程产生异源双链DNA分子，再利用能够特异性识别异源双链屮错配碱基的核酸酶，从错配处切开DNA,然后进行双色电泳分析筛选突变体。该技术将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和高通虽检测方法有效结合，可以发现分析目标区域点突变，是一种全新的高通量、低成木的反向遗传学研究方法。1.2TILLING技术的发展TILLING技术开始是利川变性高效液相

3、色谱(DHPLC)来检测DNA池屮的突变的皿,但这种检测手段不能用于大规模的突变体筛选,TILLING技术的应用也仅少数物种突变体库的筛选和突变体检测。随着应用领域的不断拓宽,TILLING技术也逐步得到了发展和完善。1.2.1双色红外荧光扫描对TILLING技术的作用双色红外荧光扫描系统的引入捉高了突变筛选效率双色红外荧光扫描系统的出现大大提高了突变筛选效率。该系统是利用一对不同荧光进行标记的引物来扩增几个样品混合后的DNA模板,PCR产物经变性示再逐渐复性,如果在混合的DXA样品屮存在一个突变样品，那么扩增产物屮就会形成异源双链分子,这些异源

4、双链分子即可被核酸内切酶剪切，酶切产物利用变性聚内烯酰胺凝胶电泳进行分离。因为被切开的片段两端采用的是不同的荧光染料标记，那么在图像上下方都会出现一个条帯，就可以通过估计载冇3’和5’端标记的这两个条带的大小推测突变发生的位置。如果在一个混合样品小检测到了突变，再逐一对该混合样晶池中的侮一个DNA样晶按同样的方法重新进行筛选,总到筛选到突变个体。研究表明，当将一对分别用700nm和800nm荧光染料标记的引物和没有标记的引物混和后进行PCR110F增时,扩增产物会非常稳定⑸,这样做既节约了检测突变体的成木，又提高了检测的效率。1.2.2CELL酶

5、的引入解决了TILLING技术的核心问题从TILLING技术的操作流程来看，形成界源双链后怎样识别并有效地切割其屮的错配碱基是TTLLTNG技术的关键点。一些核酸内切酶(S1)核酸酶冋、T4内切酚阴和绿豆核酸酶口"曾被川于尝试切割这些界源双链分子，但效果并不理想，绿豆核酸酶切割处局限于富含TA区域，并口只有在pH值酸性条件卜•才能进行有效切割17-，81oSl核酸酶对多个碱基的错配切割效率较高，但不能对SNP进行有效地切割网。从芹菜小提取的核酸酶CELL能高度特异的识别双链DXA屮错配的碱基。该酶提取技术较为简单，在常规的实验室即可进行。并且CE

6、LL最佳的切割条件为pH值中性,在和存在条件下能对包括SNP在内的碱棊错配进行冇效切割如。该酶是通过识别错配碱棊并在错配碱基的3’端进行切割的，酶切后的产物经变性的序列胶(PAGE)分离，能够将超过lk的PCR扩增产物内的点突变定位在儿个碱基对内：2°-2，1o林英等从芹菜中粗纯化了CELL酶，以杂合双链DNA为底物，研究了CELL酶在不同纯化程度、不同温度、不同处理时间以及有无TaqDNA聚合酶条件下的错配切割活性。研究发现,CEI丄酶的最适活性温度范围为45〜50°C，处理时间长达150min时,CEI丄酶仍能特异识别并切割错配碱基;在含有T

7、aqDNA聚合酶的酚切体系中,CELL他错配切割效果更佳。对CELL他的捉取及活性分析，为TILLING技术大规模和低成木地应用于功能基因组研究提供了保障冋。CELL酶被成功应用于TILLING技术是大大地提高了工作效率冋，是TILLING得到广泛应用的基础。各种软件的开发推动了TILLING技术的发展TTLLTNG技术的快速发展得益于一些基于网络的相关软件的开发。比如基于网络的C00DDLE软件可预测慕因的重要功能域或氨基酸的变化对基因影响较大的影响。突变体分析是生物学研究中最重要的研究工具Z—，人们对植物生长发育、细胞生物学以及生物代谢的深入

8、研究和理解都离不开突变体分析。人为地创造突变体已经成为近80年來遗传学研究的主要驱动力。在各种诱导突变的物质屮,化学诱变剂的应用尤其广泛