western blot配方与方法

western blot配方与方法

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1、WesternBlot配液:1.10%SDS溶液(m/v):SDS0.1gDDH2O1ml加热溶解,室温保存,用后马上拧紧瓶盖。2.10%过硫酸铵:APS0.1gDDH2O1ml由于过硫胺酸会缓慢分解,最好新鲜配制,或隔周配制(也可每200微升EP分装,4℃保存4W,-20℃保存1月)3.1×电泳缓冲液Trisbase3.028gGlycine14.4gSDS1.0g用蒸馏水溶解至1000ml,调整PH8.3。冰箱内可保存数月。4.10×转膜液(储存液)甘氨酸72.07gTrisbase15.14gDDH2O400

2、ml加水至500ml,储存液不加甲醇,4℃保存。1×转膜液1L配制:10×转膜液储存液100ml,150ml甲醇,加DDH2O750ml,PH8.5,定容至总量1L5.1×转膜液(现配现用):Trisbase3.03gGlycine14.42g甲醇150ml加水定容至1000ml6.10×TBS:Trisbase12.1gNaCl40g加水,用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml7.TBST:1×TBS/吐温=1000/18.封闭液:脱脂奶粉2gTBST40ml配胶:先配分离胶,再配积层胶。一般两者同时配制,只

3、是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶,而积层胶放4℃,等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。(为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,一般加至原来的2-3倍,根据实验当时的温度适当调整)2ml5%积层胶3ml5%积层胶5ml8%分离胶5ml10%分离胶10%两块胶5ml15%分离胶超纯水1.42.12.31.92.851.130%Acr/Bic0.330.4951.31.72.552.51.5mol/LTris·HCl(pH8.8)1.31.30.951.31mol/LTris·HCl(pH6.8)0

4、.250.37510%SDS0.020.030.050.050.0750.0510%APS(过硫胺酸)0.020.030.050.050.0750.05TEMED0.0020.0030.0030.0020.0030.002双丙烯酰胺:丙烯酰胺摩尔比1:29配制时,SDS-PAGE有效分离范围凝胶浓度(%)线性分离范围(KD)1512-431016-687.536-945.057-212按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度,一般地,5%的凝胶可用于60~200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离,10

5、%用于16~70kDa,15%用于12~45kDa。步骤:(1)清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。(2)配胶与上样:先配分离胶,再配积层胶。1、玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧(一定要对齐,以免漏胶)。然后垂直卡在夹子上准备配胶。2、按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,用枪吸取1ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可,给积层胶留出足够空间(梳齿长再加1cm)。然后胶上加一层去离子水,液封后的胶凝的

6、更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢,否则胶会被冲变型。)3、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝固(30min)。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上的水,再用去离子水洗涤数次,并用滤纸将水吸干。4、按前面的方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平(梳子使用前保证干净且干燥)。待到浓缩胶凝固后(室温3

7、0min),将凝胶放入电泳槽中,小玻璃板面朝内(若只跑一块胶,则槽的另一边要垫一块塑料板,且有字的一面朝内)。在上下槽内加入电泳液,上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘,下槽内的电泳液应没过金属丝,排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、用电泳液冲洗一下浓缩胶,(目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺,以免造成条带变形)可以前一天配胶备用,保鲜膜4度保存,可一周。6、制备样品:测完蛋白浓度后,计算含20—50μg蛋白(根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量,一般

8、为40—50ug。)的样品体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中,加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×(上样缓冲液与样品蛋白体积之比为1:4)。(上样体积一般在10μl与20μl之间)(其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl,胶做得很好的话,50μl问题也不大)上样前要将样品100℃加热5-15min使蛋白变性,立即冰浴,然后低速

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