western_blot配方与方法

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1、WesternBlot觉得割胶用电话卡很容易割破，然后剪膜目测真的好难，膜的蛋白面不好判断不知道有没有好的方法？配胶：先配分离胶，再配浓缩胶。（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回）我们实验室常配的（单位均为ml）分离胶10ml分离胶15ml浓缩胶2ml浓缩胶4ml超纯水2．03．01．42．730％Acr/Bic（丙烯酰胺）4．06．00．330．671.5mol/LTris·HCl（pH8.8）3．85．71mol/LTris·HCl（pH6.8）0．250．510％SDS0．10．150．020．0410%APS（过硫胺酸）0．10．150．020．04TEMED0．0

2、040．0060．0020．004注意：TEMED量很少，所以要注意观察有没有吸上来，也要注意不能插太深，防止枪头壁上粘太多步骤：.样品制备1．培养细胞或药物处理。2．弃培养基，用1XPBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3．加入1XSDS样品缓冲液(6-wellplate(6孔板),100μl/w或75cm2plate,500-1000μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。5．煮沸样品5minutes。6．离心12000g,5min，取上清。（可省）7．电泳分离：上样15μl~20μl至SDS-PAGE胶(10cmx10cm

3、)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1mlper107cells/100mmdish（培养皿）/150cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样20~30μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精

4、将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）配胶与上样：先配分离胶，再配浓缩胶。1、玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧（一定要对齐，以免漏胶）。然后垂直卡在夹子上准备配胶。2、按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层无水酒精，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说

5、明胶已凝固（30min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上的酒精，并用滤纸将酒精吸干。4、按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。待到浓缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内（若只跑一块胶，则槽的另一边要垫一块塑料板，且有字的一面朝内）。在上下槽内加入电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的两边竖

6、直向上轻轻将其拔出。5、用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周。6、制备样品：测完蛋白浓度后，计算含20—50μg蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量，一般为40—50ug。）的样品体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×（上样缓冲液与样品蛋白体积之比为1:4）。（上样体积一般在10μl与20μl之间）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话，50μl问题也不大）上样前要将样品100℃加热5-15min使蛋白

7、变性，立即冰浴，然后低速离心5min。（可以使用PCR仪进行变性（95℃,10min））应根据上样缓冲液浓度的不同，制备样品。样品分装成小管，储于-80℃。蛋白质在非变性条件下的电泳分离是由其分子量大小与电荷共同决定的，在变性条件下与SDS结合后，其电泳分离只由分子量大小决定。7、加足够的电泳液后准备上样。上样之前一定要把上样孔冲洗干净，冲走未凝固的丙烯酰胺。用移液枪将样品吸出，注意不要吸进气泡。将枪头插至上样孔中加入样品（上样速度要快，防止样品扩散导致相