cd通过调节egfr磷酸化促进口腔鳞癌的作用及机制研究

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1、上海交通大学医学院2012级博士学位论文上海交通大学SHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目CD166调节EGFR磷酸化在口腔鳞癌的作用及机制研究学科专业口腔基础医学（口腔颌面外科）作者姓名贾国栋指导教师张萍陈万涛教授答辩日期2015年04月基金项目：国家自然科学基金面上项目（81272978,81102050） 上海市科委项目（2010Y146）东方学者（1220000243）上海交通大学医学院2012级博士学位论文CD166通过调节EGFR磷酸化促进口腔鳞癌的作用及机制研究CD166medi

2、atedEGFRphosphorylationpromotethegrowthoforalsquamouscellcarcinoma研究生：贾国栋导师：张萍、陈万涛教授学号：0127239231专业：口腔基础医学（口腔颌面外科）申请学位级别：博士培养单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院答辩日期：2015年4月基金项目：国家自然科学基金面上项目（81272978,81102050,41271341）上海市科委项目（13140902600，2010Y146）东方学者资助项目(1220000243)关键词：口腔鳞癌；CD166；EGFR；磷酸化；泛素化Keywords

3、:oralsquamouscellcarcinoma,CD166,EGFR,phosphorylationubiquitinylation上海交通大学医学院2012级博士学位论文CD166通过调节EGFR磷酸化促进口腔鳞癌的作用及机制研究摘要目的：我们实验室前期采用膜蛋白质组学技术，研究口腔鳞癌肿瘤干细胞表面特征性膜蛋白分子标志物时，发现多种粘附相关分子在肿瘤干细胞中表达异常，其中活化白细胞粘附分子（activatedleukocytecelladhesionmolecule,ALCAM）、又名CD166，其表达水平与肿瘤干细胞的生物学行为密切相关。CD166可以作

4、为细胞膜表面标志物来富集口腔鳞癌干细胞，它还参与了对肿瘤干细胞干性的维持。高表达CD166的鳞癌患者往往易复发、预后差，提示CD166是一个潜在的肿瘤干细胞靶向治疗靶点。本项目旨在前期研究工作的基础上，深入研究CD166调控口腔鳞癌干细胞干性的具体作用，初步阐明CD166与EGFR信号通路之间的关系。方法：选取口腔鳞癌患者40例，各取癌组织及癌旁正常组织。实时定量PCR检测组织样本中CD166的mRNA水平；随机选取口腔鳞癌标本20例，蛋白印迹技术检测蛋白表达水平。用微球培养技术，检测微球中CD166的mRNA水平及蛋白水平。在口腔鳞癌细胞系中检测CD166敲除和过

5、表达情况下，应用生长曲线，侵袭实验，平板克隆，微球培养等细胞生物学技术，检测、分析CD166对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、克隆形成等生物学行为的影响；并通过激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化；应用裸鼠移植瘤技术，检测CD166对裸鼠体内成瘤能力的影响。通过激光共聚焦显微镜，检测EGFR和CD166共定位情况。通过co-IP检测EGFR和CD166相互作用。通过免疫组化检测CD166与pEGFR(1068)在口腔鳞癌临床样本中的表达水平。通过CD166抑制和过表达技术，观察CD166对EGFR信号通路的调控及其对下游信号分子的影响。结果：CD166的转录和翻译水平在口腔鳞

6、癌细胞系及组织样本中表达显著上调，明显高于对照组（P=0.001）。在口腔鳞癌细胞微球中，CD166的mRNA和蛋白水平比贴壁培养的细胞显著增加。在口腔鳞癌细胞系中过表达CD166，能明显提高细胞克上海交通大学医学院2012级博士学位论文隆形成能力、侵袭能力和微球形成能力；抑制CD166，结果正好相反。免疫组化染色结果显示，CD166阳性率和pEGFR为正相关关系（r=0.373，P＜0.001）。激光共聚显微镜焦蛋白定位显示，CD166与EGFR在口腔鳞癌细胞的细胞膜上存在明确的共定位。Co-IP检测结果发现，CD166与EGFR形成蛋白复合体。在口腔鳞癌细胞系细

7、胞中过表达CD166、EGF刺激下，可以明显提高pEGFR（1068、1045）、pFAK、pERK、pAKT蛋白的表达水平，并提高pEGFR稳定性，减少pEGFR泛素化降解。相反，抑制CD166，可以明显降低pEGFR（1068、1045）、pFAK、pERK、pAKT表达水平，降低pEGFR稳定性，增加了pEGFR泛素化降解。通过激光共聚焦显微镜检测也发现，在EGF刺激下，口腔鳞癌细胞过表达CD166后，可以提高pEGFR的稳定性；反之，抑制CD166，可以加快pEGFR降解；同时观察到细胞骨架排列的变化。通过与表皮生长因子受体相互作用，CD166可以通过降