氨基甾体类抗白血病化合物对k白血病细胞系的作用及其机理研究

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1、中南大学硕士学位论文氨基甾体类抗白血病化合物对K562白血病细胞系的作用及其机理研究姓名：董俊申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：何群20080501摘要目的：观察氨基甾体类化合物对人慢性粒细胞白血病Ｋ５６２细胞系的抑制增殖和诱导分化作用，并进一步探讨其作用机制。方法：采用液体培养实验，集落培养实验，ＭＴＴ实验来观察氨基甾体类化合物对Ｋ５６２细胞系的抑制增殖能力；采用Ｗｒｉｇｈｔ染色，联苯胺染色，细胞表面ＣＤ７１表面标记物的检测来观察氨基甾体类化合物对Ｋ５６２细胞系的诱导分化作用。采用荧光分光光度计，激光共聚焦扫描仪，原子吸收光谱仪检测Ｋ５６２细胞内外钙离子浓度（〔Ｃａ

2、２＋〕）的变化。为了进一步了解氨基甾体类化合物对Ｋ５６２细胞的影响与细胞内外〔Ｃａ２＋〕以及钙通道之间的关系，我们选取阿糖胞苷，Ｌ型钙通道激动剂ＢａｙＫ８６４４，ｃａ２＋螯合剂ＥＧＴＡ和有报道称能使Ｋ５６２细胞内〔Ｃａ２＋〕升高的吲哚美辛作用于Ｋ５６２细胞，采用ＭＴＴ实验，联苯胺染色来观察它们对Ｋ５６２细胞的增殖和分化的影响，同时利用原子吸收光谱仪检测它们对Ｋ５６２细胞内总〔Ｃａ２＋〕的影响。结果：１氨基甾体类化合物对Ｋ５６２细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面：ＭＴＴ结果显示，终浓度为ｉ０一Ｓｍｏｌ／Ｌ的８种氨基甾体类化合物作用于Ｋ５６２细胞第５ｄ，除了氨基甾体Ｇ对Ｋ５６

3、２细胞的抑制增殖作用不明显外，其余７种氨基甾体类化合物对Ｋ５６２细胞的增殖有不同程度的抑制作用，生长抑制率（ＧＩＲ）分别为Ａ（６１．２１±１０．０３）％，Ｂ（６３．０３±２．２８）％，Ｃ（４３．３８±２．９６）％，Ｄ（５４．４９±１．１４）％，Ｅ（２４．４３±１．２６）％，Ｆ（５２．９６±８．７４）％，Ｈ（７９．８８±８．８８）％。分化方面：联苯胺染色结果显示，终浓度为１０—５ｍｏｌ／Ｌ的８种氨基甾体类化合物作用于Ｋ５６２细胞第５ｄ，处理组各组联苯胺染色检测值较对照组均有升高，分化程度分别为对照组的１．９６（Ａ）倍，１．９２（Ｂ）倍，２．２８（Ｃ）倍，２．５５（Ｄ）倍，２．

4、３０（Ｅ）倍，１．９９（Ｆ）倍，２．１７（Ｇ）倍，２．３０（Ｈ）倍。以其中一种氨基甾体Ｃ（代号Ｈ５１８１７）为代表做进一步的研究，探讨氨基甾体类化合物对人慢性粒细胞白血病Ｋ５６２细胞系的作用机制。７２氨基甾体Ｈ５１８１７对Ｋ５６２细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面：加入不同终浓度的氨基甾体Ｈ５１８１７（１０。９～１０一５ｍｏｌ／Ｌ）与Ｋ５６２细胞连续培养，当培养至第３ｄ和第５ｄ，１０巧ｍｏｌ／Ｌ的氨基甾体Ｈ５１８１７对Ｋ５６２细胞的生长有抑制作用，细胞计数的ＧＩＲ分别为（３８．３６±１０．５４）％和（４５．９２±１１．１５）％；ｉ０‘５ｍｏｌ／Ｌ的氨基甾体Ｈ５１８１７作用

5、于Ｋ５６２细胞第８ｄ的集落培养结果显示，Ｋ５６２细胞的增殖明显受到抑制，ＧＩＲ为（７７．９８±６．９８）％。分化方面：终浓度为１０’５ｍｏｌ／Ｌ的氨基甾体Ｈ５１８１７作用于Ｋ５６２细胞第５ｄＷｒｉｇｈｔ染色，镜下观察发现细胞体积变大，核浆比例减少，有核切迹，核染色质浓集变粗，胞质增多，浅染，核周胞质出现淡染区：Ⅱ流式细胞仪分析显示：终浓度为１０‘５ｍｏｌ／Ｌ的氨基甾体Ｈ５１８１７作用于Ｋ５６２细胞第５ｄ，６７．７４％的细胞胞膜上ＣＤＴｌ表面标记表达呈阳性。３ＥＧＴＡ，ＢａｙＫ８６４４，吲哚美辛，阿糖胞苷对Ｋ５６２细胞增殖能力和分化能力的影响增殖方面：ＥＧＴＡ，ＢａｙＫ８６４

6、４，吲哚美辛，阿糖胞苷作用于Ｋ５６２细胞第５ｄ的ＭＴＴ结果表明：Ｏ．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＧＴＡ对Ｋ５６２细胞无明显的抑制增殖作用，而０．Ｏｌｍｍｏｌ／Ｌ的ＢａｙＫ８６４４，吲哚美辛和阿糖胞苷能分别抑制其增殖（ｐ＜０．０５），ＧＩＲ分别为（１４．９４±０．０１）％，（１８．３０±０．０２）％，（５０．１０±０．１２）％。分化方面：ＥＧＴＡ，ＢａｙＫ８６４４，吲哚美辛，阿糖胞苷作用于Ｋ５６２细胞第５ｄ的联苯胺染色结果显示：经０．Ｏｌ一－－ｌｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＧＴＡ处理的Ｋ５６２细胞分化程度较对照组无明显的差异（ｐ＞Ｏ．０５），而０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＢａｙＫ８６４４，吲哚美辛

7、和阿糖胞苷使Ｋ５６２细胞的分化程度分别达到对照组的１．９８倍，２．９４倍和３．２９倍。４氨基甾体Ｈ５１８１７对Ｋ５６２细胞内外总〔Ｃａ２＋〕的影响利用荧光分光光度计检测，激光共聚焦扫描仪扫描发现：经终浓度为１０｛ｍｏｌ／Ｌ的氨基甾体Ｈ５１８１７处理Ｋ５６２细胞一定时间后，细胞内游离〔Ｃａ２＋〕的荧光强度有所下降；利用原子吸收光谱仪检测Ｋ５６２细胞外不同的环境条件下氨基甾体Ｈ５１８１７对Ｋ５６２细胞内外总〔Ｃａ２＋〕的变化发现：ＤＭＥＭ组细胞内总〔Ｃａ２＋〕显著下降，下降率为（３２．０１±２．３６）％，但细胞外〔Ｃａ