蛋白质指纹图谱技术探究

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1、蛋白质指纹图谱技术探究 1蛋白质组学研究方法 目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中已经得到越来越多的应用。在蛋白质组学中以下三项技术的进步对于实验诊断与临床医学研究进展将具有决定性的影响[2~5]。 1•1蛋白质的分离技术 在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一,通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物;第二,通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-dmiensionalgelelectrophoresis,2-DE)、

2、高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)、毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)、亲和层析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmi-croarray)、磁性微球(magneticbeads)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白质指纹图谱技术克服了以往技术的缺点,具有高灵敏度、高通量、结果重复性好(CV<5~10%)、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛,不需作特殊前处理,可以直接点

3、样检测,如血清、尿液及组织液等;检测快速,一般一例标本的检测时间仅需约5min,从标本制备到出结果全过程仅约1h。蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白质指纹图谱技术有可能在体液中潜在肿瘤标志(tumormarker)检测方面创造革命性突破。 1•2生物质谱(biologicalmassspectrometry)技术 生物质谱是化学领域中非常重要的一种分析方法。它通过测定分子质量和相应的离子电荷实现对样品中分子的分析。19世纪末科学家已经奠定了这种方法的基础,1912年科学家第一次利用它获得对分子的分析结果。在质谱分析领域,已

4、经出现了几项诺贝尔奖成果,其中包括氢同位素氘的发现(1934年诺贝尔化学奖成果)和碳60的发现(1996年诺贝尔化学奖成果)。不过,最初科学家只能将它用于分析小分子和中型分子,由于生物大分子比水这样的小分子大成千上万倍,因而将这种方法应用于生物大分子难度很大。美国科学家约翰•芬恩与日本科学家田中耕一在传统的质谱分析法基础上发明了一种新方法:对生物大分子的质谱分析法。首先将成团的生物大分子拆成单个的生物大分子,并将其电离,使之悬浮在真空中,然后让它们在电场的作用下运动。不同质量的分子通过指定距离的时间不同,质量小的分子速度快

5、些,质量大的分子速度慢些,通过测量不同分子通过指定距离的时间,就可计算出分子的质量。蛋白质组学常用的生物质谱有五种,分别简介如下。 1•2•1电喷雾电离质谱(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS):在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片

6、离子,使质量电荷比(masstochargeratio,m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子质量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 1•2•2基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理:将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射吸收能量,导致能量蓄积并迅速产

7、热,从而使基质晶体升华,致使连同分析物一起进入气相。MALDI-TOF-MS所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI-TOF-MS与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)。 1•2•3快原子轰击质谱(fastatombomebardmentmassspectrometr

8、y,FABMS):一种软电离技术,应用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器。这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。 1•2•