对培美曲塞耐药胰腺癌patu8988细胞株克隆、侵袭能力及相关耐药基因的研究

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1、对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株克隆、侵袭能力及相关耐药基因的研究作者：杨军，石欣,严伟,林士波,顾海涛,钱程佳【摘要】　　目的：探讨对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株相对于亲本株在细胞克隆、侵袭能力及多药耐药相关蛋白1(MDR1)、ABC多药转运蛋白G家族成员2(ABCG2)、ABC多药转运蛋白C家族成员3(ABCC3)耐药基因的变化。方法：采用双层软琼脂克隆实验分别在无药及加入500μmol·L-1培美曲塞的环境下测定胰腺癌Patu8988耐药株及亲本株克隆生成能力的改变；采用Transwel

2、l侵袭小室检测两种条件下胰腺癌Patu8988侵袭能力的差异；采用RTPCR法检测胰腺癌Patu8988细胞MDR1、ABCG2、ABCC3的mRNA表达水平,Werstenblot检测ABCG2和ABCC3的蛋白表达水平,免疫荧光及激光共聚焦检测ABCG2的表达及分布。结果：在无药及加入500μmol·L-1培美曲塞的环境下,对培美曲塞耐药胰腺癌Patu8988细胞株的增殖克隆能力均与其亲本株有差异(P＜0.05),而两种培养条件下胰腺癌Patu8988细胞株的侵袭能力变化差异无统计学意义(P＞0.05)。RT

3、PCR检测显示,在耐药株中ABCG2、ABCC3mRNA表达分别是其亲本株的2.5倍和1.6倍左右,而MDR114mRNA表达仅提高到1.2倍；Werstenblot结果显示蛋白表达为其亲本株的2.4倍和1.5倍。免疫荧光检测结果显示,耐药株中ABCG2的荧光强度较强,而其亲本株细胞较弱。激光共聚焦显示，耐药株中ABCG2表达主要分布于细胞膜，细胞质内也有少量分布。结论：相对于亲本株，对培美曲塞耐药的胰腺癌Patu8988细胞株克隆能力加强,而侵袭能力无明显改变。多药耐药基因表达均有不同程度的提高,以ABCG2基因表

4、达提高尤为明显,而且其在耐药株中主要分布在细胞膜,细胞质内也有分布。【关键词】胰腺肿瘤；获得性耐药；培美曲塞；ABC多药转运蛋白G家族成员2　　［Abstract］Objective:Toinvestigatethecloningcapability,invasionandassociatedmultidrugresistancegenes:MDR1(Pgp),ABCG2,ABCC3ofPatu8988humanpancreaticcancercellsresistancetothepemetrexedcompa

5、redwithit′sparentalstrain.Methods:ThecloningcapabilityofPatu8988humanpancreaticcancerandit′sparentalstrainweredetectedinconditionfreeoradding500μmol·L-1pemetrexedbysoftagarcloningmethod.Theinvasionabilitybetweentthemweredetectedbytranswellinvasionchamber.ThemRN

6、AexpressionofMDR1,ABCG2andABCC3weredeterminedbyRTPCR,ABCG2andABCC3proteinexpressionlevelsweredetectedbyWerstenblot,theexpressionanddistributionofABCG2weredetectedbyimmunofluorescenceandlaserscanningconfocalmicroscopy.Results:Thecloningcapabilitybetweendrugfre

7、e14andadding500μmol·L-1pemetrexedwassignificantlydifferent(P＜0.05),whereastherewasnosignificantchangesoftheinvasionabilitybetweenthem(P＞0.05).RTPCRandWerstenblotshowedthemRNAandproteinlevelsofABCG2,ABCC3werealmost250%and150%inthedrugresistantcellsthantheirpar

8、entalcells,whiletheexpressionofMDR1mRNAincreasedonly20%.ImmunofluorescenceshoweddrugresistantcellsofABCG2strongerfluorescenceintensitythantheirparentalcells.Laserconfocalde