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1、应用CSC-GE-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植的血管生长相关基因作者：王宁宁，张玉凤，张红霞，谭金凤，谢洪哲，姚书忠，庄广伦，牛刚，黄建昭，何勉【摘要】【目的】探讨子宫内膜异位早期种植的相关基因，特别是与早期种植相关的血管生长基因。【方法】采用裸鼠人子宫内膜皮下种植的方法，建立裸鼠人子宫内膜异位症模型，在种植后14d，取出成模病灶与未种植内膜进行CSC-GE-80基因芯片筛查比较。【结果】在基因表达谱中最有显著性上调基因50个，最有显著性下调基因47个，包括生长因子和细胞因子及其受体的变化，其中生长因子受体结合蛋白
2、10（growthfactorreceptor-boundprotein10，Grb10）与丁酸盐反应因子1（butyrateresponsefactor1）中表皮生长因子（EGF-responsefactor1）上调明显，下调明显胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin-likegrowthfactorbindingprotein7）。【结论】通过基因筛查我们初步考虑生长因子结合蛋白10（growthfactorreceptor-boundprotein10）有可能参与早期异位内膜的血管生长。【关键词】子宫内膜异位症；早
3、期种植；裸鼠模型；基因芯片；血管生长11子宫内膜异位种植的原因，一直是人们是人们关注的热点。在我们前期的研究中，通过裸鼠进行人子宫内膜的异体异位种植，我们发现血管生成及其相关因子如血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）在异位内膜的早期种植与生长的过程中，起十分重要的作用[1,2]。但子宫内膜异位种植的早期，究竟是哪些基因发生变化或者在这一过程中起到作用，仍不十分清楚。我们拟通过基因芯片筛查种植在裸鼠的人子宫内膜异位病灶，为早期的种植相关基因提供了一定的理论依据。1材料与方
4、法1．1实验动物由中山大学实验动物中心提供SPF级饲养BALB/c裸鼠,雌性,体质量17~21g,实验过程饲养在清洁环境，（温度：22～24℃，湿度：45%～70%，12h黑白交替），每1只放1笼，共5只，饲养予以灭菌的水与饲料，每周添加鸡蛋、葵花籽以增加蛋白质等营养的摄入。1.2人子宫内膜组织的获取11子宫内膜取自子宫腺肌症伴盆腔子宫内膜异位症患者2例，年龄分别为43与47岁。手术前6个月未进行激素类药物治疗，在进行全子宫切除后立即进行内膜组织的刮取，种植前部分内膜进行HE染色组织病理分析。取材后将内膜无菌保存在德氏改良基
5、础培养基（Dulbcco′smodifedeaglemedium，DMEM）培养液中，一部分剪成3mm×3mm大小，另一部分继续剪成0.5mm×0.5mm碎屑液,诊刮后60min内完成皮下种植术。两例患者术后病理均提示子宫腺肌症，分泌期子宫内膜。1.3BALB/c裸鼠人子宫内膜异位症的模型建立详细方法参照参考文献[1]进行,子宫内膜裸鼠皮下异位种植14d成模后取出进行检测。1.4主要试剂Cy3荧光素标记的单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（Cy3conjugatedmonoclonalanti-α-smoothmuscleact
6、inclone,1∶400）购自英国Sigma公司；FITC荧光素标记单克隆羊抗兔抗体（1∶200）购自购自美国SantaCruz公司。DMEM培养液购自GiBco公司。TrizolReagent购自LifeTechnologies公司。QiageneRT-PCR、Qiagene快速PCR纯化试剂盒购自Qiagene公司。AmbionmessageAmpaRNA试剂盒购自Ambion公司。CyScribe11cDNA荧光标记试剂盒购自Amersham生物制药技术有限公司。基因表达谱芯片CSC-GE-80由深圳微芯公司提供。1
7、.5种植病灶的基因芯片检测1.5.1总RNA提取保护液中保存的小块新鲜组织采用Trizol的方法进行提取与微量扩增、纯化，把所得到的cDNA真空抽干至体积小于8μL，并保存在-20℃。接着RNA的扩增aRNA的纯化参照试剂盒进行,将aRNA样品于-80℃存放，取5～20μg进行反转录标记。1.5.2探针标记与芯片杂交探针标记采用aRNA10μg,secondroundprimer1μL,SpikeRNA2μL,DEPCwater加至10μL,70℃5min变性，然后冰上冷却后，采用Buffer4μL,0.1mol/LDTT2
8、μL,dNTPmix1μL,dye-dCTP1μL,RibonucleaseInhibitor1μL,RT1μL,42℃连续2h,反应完毕后，用2μL0.5mol/LNaOH,处理后，然后用将pH值调为中性。采用QIAquickPCRPurificationKit纯化按照说明书进行。芯片杂
