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1、川芎嗪对依托泊苷诱导小细胞肺癌细胞凋亡增敏作用的评判作者：崔丽娟张会军阎蕴力阴梅云郑力芬【关键词】四甲基吡嗪;,,依托泊苷;,,脱噬作用;,,流式细胞术,,,, 摘要：目的：观察低浓度(10μg/ml)的中药钙拮抗剂川芎提取物川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)与化疗药物依托泊苷(etoposide,VP16)合用对人小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)细胞的影响。方法：用MTT法观察药物对体外培养的人小细胞肺癌H446细胞存活率的影响;用吖啶橙/溴乙啶双荧光染色法检测凋亡细胞，采用流式细胞术分析药物对H
2、446细胞周期的影响。结果：TMP和VP16合用与单用VP16相比细胞存活率明显下降,VP16的浓度在0.1、1、10、100μg/ml时,细胞存活率分别为(93.85±2.51)%、(91.90±2.10)%、(66.64±3.73)%和(8.21±1.84)%。VP16与低浓度的TMP联用后,上述浓度细胞存活率分别降为(90.80±1.20)%、(78.96±1.94)%、(51.48±2.52)%和(2.56±1.44)%,其合并指数为0.85,增效倍数为4.32。双荧光染色法证实TMP可增强VP16的凋亡诱导作用;细胞周期分析表明低浓度TMP对
3、细胞周期无明显影响,VP16半数抑制浓度使细胞生长停滞在S期,抑制细胞有丝分裂及DNA合成,两者合用主要表现为VP16的作用。结论：13低浓度的TMP与VP16合用可增加对小细胞肺癌细胞的诱导凋亡作用。 关键词：四甲基吡嗪;依托泊苷;脱噬作用;流式细胞术 川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，又称四甲基吡嗪，属酰胺类生物碱，该制剂主要应用于心脑血管疾病等［1］。近年来文献报道TMP与维拉帕米同样具有钙通道阻滞活性，是一种中药钙通道阻滞剂［2］，钙拮抗剂的化疗增敏效应已被广泛认同［3］。但由于这些药物增敏所需剂量过大，严重时可导致心脏毒副作用等原因，难以在
4、临床推广应用［4］。而TMP临床应用多年，作用缓和，毒副作用较少。本研究应用MTT法、双荧光染色法、流式细胞术观察低浓度的TMP与临床常用的化疗药物依托泊苷合用对人小细胞肺癌H446细胞的影响，旨在为小细胞肺癌临床治疗提供新的经验。 1材料与方法 11材料 人小细胞肺癌H446细胞株购于中国协和医科大学细胞库；TMP购自北京第四制药厂；VP16购自北京双鹤现代医药技术有限公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；吖啶橙、溴乙啶、MTT、RNA酶购自华美生物试剂公司。13 12方法 121细胞培养将H446细胞用RPMI1640培养基
5、培养，内含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，置370C，5%CO2环境下培养。每日观察细胞生长情况。 122MTT法检测H446细胞存活率根据文献所述方法进行MTT检测［3］，实验分组如下：①单用不同浓度的TMP；②单用不同浓度的VP16；③低浓度的TMP分别与不同浓度的VP16联合同时用药；④对照组加入生理盐水。以上各组细胞与药物共同作用24小时后，在全自动酶标仪上选择波长570nm测定吸光值（A值），实验重复3次，取平均值。根据A值计算H446细胞存活率，计算公式［3］为： 细胞存活率（%）=用药组A值对照组A值×1
6、00% 根据各药物细胞存活率，由药物浓度的对数值与细胞存活率线性回归求出各药物的半数抑制率（IC50）［3］。应用以下公式计算出联合用药的合并指数［5］： 合并指数CI=联合用药IC50时的A药用量A药单用时IC50的值+联合用药IC50时的B药用量B药单用时IC50的值13 当CI<0.95时表示两种药物呈协同作用；当CI>1.05时呈拮抗作用；0.96 增效倍数=单用化疗药的IC50联合用疗药的IC50 123吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）双荧光染色取吖啶橙和溴乙啶各1mg，分别溶于10mlPBS(PH7.2)中，配成100μg
7、/ml储备液，用前等量混合备用。取细胞悬液100μl,加入AO/EB混合染料4ml混匀，滴至载玻片上，荧光显微镜下观察、照相［6,7］。实验分组同上，分别计算凋亡率。 124流式细胞术不同组别细胞经药物作用24小时后0.02%EDTA消化、离心，用冷PBS洗两次，70%乙醇固定细胞24小时。上机测定前离心去乙醇，用PBS洗两次，加100μg/mlRNase37℃消化30分钟。碘化丙锭50μg/ml染色30分钟,经尼龙网过滤后，用FACSTARCalibur型流式细胞仪测定。实验结果经计算机软件处理，计算出细胞周期的分布。按以下公式计算增殖指数［8］:
8、 PI（%）=S+G2／MG0／G1+S+G2／M×100% 125统计学分析13细胞存活
