小鼠着床前胚胎mir125a，mir295和mir181b的表达

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1、小鼠着床前胚胎miR125a，miR295和miR181b的表达作者：张平，杨艳红*，王晓红，王珺，姜峰，罗亚宁，姚元庆【摘要】目的：研究小鼠着床前胚胎发育过程中miRNA表达水平的变化，探讨miRNA对着床前胚胎发育过程的作用.方法：建立小鼠超排、交配系统，收集着床前胚胎，提取smallRNA；采用miRNA特异RT引物进行反转录，采用SYBRGreen实时定量PCR技术，研究miR125a,miR295和miR181b在小鼠着床前胚胎发育过程中表达水平的变化.结果：着床前胚胎发育的各阶段均表达miR12

2、5a,miR295和miR181b；随着胚胎发育进程，miR295的表达呈逐渐上升的趋势；miR125a在卵母细胞到2细胞发育阶段呈下降趋势，以后随发育进程呈逐渐上升趋势.结论：小鼠着床前胚胎中表达miRNA，着床前胚胎的发育和分化过程可能受到miRNA的调控.【关键词】微RNAs；小鼠；胚胎发育0引言11　　微小RNA（miRNAs）是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA；在个体发育不同时期有不同的表达模式［1］，miRNAs的特定功能与其表达水平高低及其对下游靶基因的调控作用有关，研究特定组织和发育的

3、特定阶段miRNA的时空表达模式，是理解其作用的关键步骤，也是目前分子生物学研究的前沿和热点问题.本研究采用miRNA特异的RT引物进行反转录，SYBRGreen实时定量PCR技术，研究miR125a，miR295和miR181b在小鼠着床前胚胎发育过程中表达水平的变化，探讨了miRNA在哺乳动物着床前胚胎发育过程中的作用.1材料和方法1.1材料昆白系健康小白鼠，雌雄兼用，购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，饲养于本院妇产科动物房，光照、黑暗各12h；严格控制温、湿度，自由摄食.昆白系6wk雌鼠（22~25

4、g）购回后饲养1wk，开始实验.昆白系8~9周龄成年雄鼠购回后单笼单放饲养3～4d后用于交配，每2mo更换一批.mirVanaTMmiRNAIsolationKit,购自Ambion公司.miR125a，miR295和miR181b特异反转录引物和PCR引物以及内参照5SrRNA的引物均购自Ambion公司的mirVanaTMqRTPCRPrimerSet.定量PCR试剂盒（SYBRGreen染料）及LightCycler3定量PCR仪为Roche公司产品.1.2方法111.2.1小鼠着床前胚胎的收集挑选发情前期

5、的雌性小鼠于16:30腹腔注射PMSG（7.5U/只），注射PMSG48h腹腔注射HCG(7.5U/只)，当晚雌、雄鼠1∶1合笼交配，次日清晨看阴栓.于交配后0.5,1.5,2.5,4.5d，分别收集卵母细胞和各发育阶段着床前胚胎［2］放入裂解液，-80℃保存待用.1.2.2低分子量RNA的提取采用mirVanaTMmiRNAIsolationKit提取总RNA，采用PEG6000（购自加拿大BBI公司）分离低分子量RNA.实验步骤简述如下：解冻-80℃冰箱保存的胚胎裂解液，震荡混匀合并同一发育时期的样品计算裂解液的体积

6、；加入1/10体积的homogenateadditive，上下颠倒混匀，冰上放置10min；加入与裂解液等体积的AcidPhenolChloroform，剧烈震荡30～60s，室温静置2~3min，12000g低温离心10min.上清移入新的离心管中，加入等体积异丙醇、0.5μL糖原上下颠倒混匀，室温静置30min，12000g离心10min；弃上清用750mL/L乙醇清洗沉淀后室温干燥2~3min，加入DEPC处理过的去离子水10~15μL，65℃恒温5min.取2μL样品分光光度计定量，剩余样品补水至总体积为50

7、μL后再加入等体积的PEG6000分离低分子量RNA［3］（含miRNA），取20ng低分子量RNA进行实验.1.2.3反转录体系及反应参数取20ng低分子量RNA，100UM11MLV（购自Invitrogen公司）,1μmol/μLmiRNA特异反转录引物，总体系为10μL反转录合成cDNA.先将模板、引物与H2O混匀后65℃变性5min后置冰上，再加入酶、PCRBuffer等试剂，反转录参数为16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃保存.1.2.5荧光定量PCR反应体系及反应参数取2μLRT产物

8、为模板及miRNA特异性PCR引物1μL，采用定量PCR试剂盒（SYBRGreen染料）及LightCycler3定量PCR仪进行PCR扩增，反应体系为20μL，严格按照试剂盒说明书操作.PCR反应参数：95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃30s，74℃读板，共进行40个循环.1.2.6PCR产物的120