胶体金免疫层析法检测h1n1甲型流感

《胶体金免疫层析法检测h1n1甲型流感》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、胶体金免疫层析法检测H1N1甲型流感【前言】1、关于免疫胶体金技术：免疫胶体金技术(ICG)是20世纪80年代发展起来的一种新型固相标记免疫测定技术。它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来，用于检测待测样品中的抗原或抗体[1]。免疫胶体金标记技术最初仅用于免疫电镜技术，近年来该方法迅速发展，应用范围也逐渐扩大，在银染色、斑点金免疫渗滤法(Dot—immunegoldFiltrationAssay，DIGFA)和胶体金免疫

2、层析诊断法(GoldImmune—chromatographicAssay，GICA)等多种免疫标记检测技术中显示出了极大的魅力[2]。在免疫渗滤技术的基础上建立了一种更加简易快速的免疫学检测技术，即胶体金免疫层析法(GICA)，最先用于检测人尿和血清中的HcG。随着单克隆技术的成熟和纳米技术的兴起，免疫胶体金技术逐渐得到完善和成熟，在免疫组织化学、生物分子识别等生物医学领域得到了迅速发展和广泛应用。2、关于H1N1甲型流感：甲型H1N1病毒属于正粘病毒科（0rthomyxoviridae），甲型流感

3、病毒属（InfluenzavirusA），其遗传物质为RNA。尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但是可造成人感染猪流感病毒的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2。甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病，与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。甲型

4、H1N1流感的群间传播主要是以感染者的咳嗽和喷嚏为媒介，在人群密集的环境中更容易发生感染，因而在社会上造成一定的恐慌。【实验目的】利用胶体金免疫层析法简便快速、准确的特点来迅速检测样本中是否含有H1N1甲型流感病毒。【材料与方法】1．1材料：辣根过氧化物酶标记的猪H1N1IgG抗体、山羊抗鼠IgG抗体；H1N1标准血清、标准抗原；H1N1克隆抗体细胞株H1—1D6和H1—1F7、待检样品(毒株、真核表达产物)等由本研究室研制并保存；二氯二甲基硅烷购自瑞典Fluka公司；其他试剂均为分析纯或生化试剂。H

5、iTrapproteinGHp层析柱；ZXIO00喷点平台系统、CM4000试纸条切刀；氯金酸(HAuC1·4H0)、柠檬酸三钠(CH5Na30·2HO)为上海生工产品；牛血清白蛋白(BSA)、PEG购自Sigma公司；硝酸纤维素(NC)膜、玻璃纤维、吸水垫、塑料背板购自北京万泰生物制品公司。1．2胶体金的制备(微波法)：取0．O1HAuC1溶液100mL放人微波炉中，在高档沸腾2min，迅速加入1柠檬酸三钠水溶液(现配)1．4mL，放入微波炉中在中高档保持3rnin，观察其颜色变化。冷却后以蒸馏水恢

6、复到原体积，在电镜下观察其分散度和均匀度及胶体金颗粒的平均直径。1．3蛋白一金复合体的制备(胶体金的包被)：1．3．1包被抗体的前处理(HiTrapproteinGHp预装柱纯化法)按说明书操作步骤进行。1．3．2蛋白与胶体金结合最佳PH测定取8个1．5mL试管，分别加入1mL20nm胶体金；用25mmol／LK2C03。将pH值分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；取96孔培养板，按pH值从低到高分别将上述胶体金100μL加入孔中，重复3次；然后每孔分别加入3μL质量浓度为1g／L的纤维素酶，混

7、合，室温下放置10～15min；每孔再分别加入20μL10%NaC1溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(x)；pH梯度为x-0.8，x-0.6，x-0.4，x-0.2,x,x+0.2，x+0.4，x+0.6，x+0.8，x+1.0。室温下放置2h持续观察胶体金颜色变化，记录仍保持红色的最低pH值。1．3．3最小蛋白质量浓度的确定将待标记蛋白质溶液以3000r／min离心20min；取1.5mL离心管，分别加入最佳pH8.2的胶体金500μL；各孔依次加入不同量

8、的蛋白(0.05～0.2g／L)100μL，混匀，室温放置15min；加入100μL10%NaC1，室温放置10min；颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白质量浓度。1．3．4单抗一胶体金的制备取10mL20nm胶体金，用25mmol/LK2C03调pH为8.2，根据胶体金总量计算出待标记蛋白质总量；在电磁搅拌下，将蛋白质溶液逐滴以1mg／5min加入胶体金溶液中；摇匀2～3min，室温放置10～15min；分别加入5%BSA至终浓度为1%，室温放置5