依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究

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1、依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究作者：王中群李丽华张哲莹赵琪曾莹吕运成赵卫星张景航【摘要】目的探讨依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化斑块的影响。方法将24只雄性新西兰白兔随机分为对照组、模型组、依折麦布干预组，每组8只。对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料中加入5mg·kg-1·d-1依折麦布，连续饲喂12w，以镜下见到内膜增生和明显的脂斑突起作为模型制备成功的标志。HE染色观察主动脉病理形态学改变，油红O染色和高效液相色谱观察主动脉平滑肌细胞内脂质蓄积情况，RTPCR检测主动脉平滑肌细胞脂质代谢相关基因CD36、

2、周脂素和三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1)mRNA的变化;westernblot观察细胞膜ABCA1、蛋白激酶Cα(proteinkinaseCα，PKCα)蛋白表达;PepTag○RAssay法检测细胞膜PKC活性。结果依折麦布可使新西兰兔动脉粥样硬化病变区内膜变薄、脂质蓄积减少进而逆转斑块的演进;相对于50μg/mloxLDL处理24h的新西兰兔主动脉平滑肌细胞，3μmol/L依折麦布可有效逆转oxLDL诱导的平滑肌源性泡沫细胞的形成，使细胞内CE/TC比值降至39.6%。依折麦布可显著下调平滑肌细胞CD36、pe

3、rilipin和PKCα的表达，上调胞膜ABCA1的表达。3μmol/L依折麦布可下调主动脉平滑肌细胞胞膜PKC活性至基线附近。结论依折麦布可能通过对PKC/CD36/perilipin/13ABCA1这些脂质蓄积调控子的影响，发挥抗动脉粥样硬化效应。【关键词】动脉粥样硬化;脂质蓄积;蛋白激酶C;依折麦布动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)性心脑血管病的演进过程中，血管壁平滑肌细胞移行增殖并蓄积脂质形成泡沫细胞是一个重要环节〔1〕，能有效抑制这一环节并促进细胞内胆固醇逆向转运的药物研发一直是动脉粥样硬化研究关注的热点。依折麦布作为一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，在临床应用中因

4、其可有效弥补他汀类药物的不足而倍受青睐〔2〕，但其抗动脉粥样硬化的具体分子机制尚不明了。本研究制备新西兰兔动脉粥样硬化模型和新西兰兔主动脉平滑肌源性泡沫细胞模型，观察依折麦布对斑块消退、细胞内脂质清除以及脂质蓄积调控子〔CD36、周脂素(perilipin)、三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)〕的影响，探讨依折麦布抗动脉粥样硬化作用的分子机制。　　1材料与方法　　1.1动物雄性新西兰兔24只，体重1.85～2.39kg，由南华大学提供，许可证号SCXK(湘)20040

5、009)。饲以普通饲料，适应环境113w。根据血清总胆固醇水平，随机分为对照组、模型组、依折麦布干预组，每组8只。　　1.2试剂与仪器胆固醇购自湖南祁东同信生化厂;依折麦布购自美国先灵葆雅(ScheringPlough)制药公司(批号H20060113)。总RNA提取试剂盒TRIzol购自上海Sangon公司;ImPromⅡTMReverseTranscriptase、PepTagR○NonRadioactivePKCAssayKit和BCATMProteinAssayKit购自Promega;MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自北京天为时代;所有引物由上海生工生物工程服务

6、有限公司合成;ABCA1、GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记二抗及WesternBlottingLuminolReagent购自SantaCruz;OilRedO购自Sigma公司;Shandon325型切片机，Olympus倒置光学显微镜，UVP凝胶成像分析系统，Eppendorf台式多功能高速冷冻离心机，BioRad垂直、水平电泳仪及转膜系统。　　1.3实验步骤对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料基础上加入5mg·kg-1·d-1依折麦布，连续饲喂12w，以镜下见到内膜增生和明显的脂斑突起作为模型制备成功的标志。　

7、　1.4低密度脂蛋白的分离、氧化修饰及鉴定参照文献〔3〕的方法制备低密度脂蛋白。取新鲜人血浆100～200ml，加入PDB以防腐抗氧化，置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200μmol/L13EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中透析48h，BCA法蛋白定量，CuSO4氧化，鉴定后过滤除菌，调蛋白浓度至1g/L，4℃保存。　　1.5病理形态学分析颈总动脉放血处死动物，取出兔主动脉。PBS漂洗3次，用10%