依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究论文

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1、依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究论文王中群李丽华张哲莹赵琪曾莹吕运成赵卫星张景航【摘要】目的探讨依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化斑块的影响。方法将24只雄性新西兰白兔随机分为对照组、模型组、依折麦布干预组，每组8只。对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料中加入5mg·kg-1·d-1依折麦布，连续饲喂12RNA的变化;loxLDL处理24h的新西兰兔主动脉平滑肌细胞，3μmol/L依折麦布可有效逆转oxLDL诱导的平滑肌

2、源性泡沫细胞的形成，使细胞内CE/TC比值降至39.6%。依折麦布可显著下调平滑肌细胞CD36、perilipin和PKCα的表达，上调胞膜ABCA1的表达。3μmol/L依折麦布可下调主动脉平滑肌细胞胞膜PKC活性至基线附近。结论依折麦布可能通过对PKC/CD36/perilipin/ABCA1这些脂质蓄积调控子的影响，发挥抗动脉粥样硬化效应。【关键词】动脉粥样硬化;脂质蓄积;蛋白激酶C;依折麦布动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)性心脑血管病的演进过程中，血管壁平滑肌细胞移行

3、增殖并蓄积脂质形成泡沫细胞是一个重要环节〔1〕，能有效抑制这一环节并促进细胞内胆固醇逆向转运的药物研发一直是动脉粥样硬化研究关注的热点。依折麦布作为一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，在临床应用中因其可有效弥补他汀类药物的不足而倍受青睐〔2〕，但其抗动脉粥样硬化的具体分子机制尚不明了。本研究制备新西兰兔动脉粥样硬化模型和新西兰兔主动脉平滑肌源性泡沫细胞模型，观察依折麦布对斑块消退、细胞内脂质清除以及脂质蓄积调控子〔CD36、周脂素(perilipin)、三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATPbindi

4、ngcassettetransporterA1，ABCA1)和蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)〕的影响，探讨依折麦布抗动脉粥样硬化作用的分子机制。1材料与方法1.1动物雄性新西兰兔24只，体重1.85～2.39kg，由南华大学提供，许可证号SCXK(湘)20040009)。饲以普通饲料，适应环境1PromⅡTMReverseTranscriptase、PepTagR○NonRadioactivePKCAssayKit和BCATMProteinAssayKit购自Prome

5、ga;MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自北京天为时代;所有引物由上海生工生物工程服务有限公司合成;ABCA1、GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记二抗及EM培养液冲洗一次。剪成1mm3左右的组织块，用弯头接种针将组织块移入25ml培养瓶壁上，加入含20%小牛血清的DMEM培养液5ml于对侧瓶底，入培养箱孵育4～6h，然后轻轻翻转培养瓶，使培养液盖过组织块。此后每3d换液一次。2loxLDL+DMEM培养基孵育24h)、依折麦布干预组(用50μg/mloxLDL+3μmol/L依折麦布

6、+DMEM培养基孵育24h)。1.7油红O染色将主动脉平滑肌细胞培养于放有盖玻片的6孔培养板内，按照主动脉平滑肌细胞培养及处理方法处理24h后吸弃旧的培养基，用PBS液冲洗3次，每次5min;50%异丙醇固定1min，油红O染色10min，苏木素衬染5min，盐酸酒精分色;水性封片剂封片，显微镜观察;细胞内脂滴呈红色，细胞核呈蓝色，图像分析系统收集图像并于显微镜下摄像保存。参照文献〔4〕方法进行脂滴染色的半定量分析，即根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”;细胞

7、脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”即为油红O染色细胞。每块玻片计数100个细胞。1.8高效液相色谱分析将经过处理的平滑肌细胞吸弃旧培养基，PBS洗2次，加入1ml0.9%NaCl溶液，细胞刮子收集细胞。冰浴中超声破碎细胞;BCA法测定蛋白含量。参照文献〔5〕方法进行高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)分析。采用C18柱以异丙醇:正庚烷:乙晴为流动相进行非梯度洗脱，流速1ml/min，柱温保持4℃，216nm检测8min。以峰面积

8、定量游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)，总胆固醇(TC)量为游离胆固醇量加上胆固醇酯的量。1.9PepTag○RAssay将处理后的平滑肌细胞提取胞浆胞膜蛋白，BCA蛋白检测试剂盒定量后参照文献〔6〕方法进行PepTag○RAssay操作。可见/紫外分光光度计读取570nm的吸光度值，以液化的不含PepTag○RPeptide的琼脂糖作为空白值。根据试剂盒提供的数据和Beer′s定律A=∑BC(A样品吸光度;肽的摩尔吸收率L·mol-1·cm-1;B比色杯宽度;C样品中肽浓度mol/L)逐步计