定量pcr结合混合标本检测献血者hcvrna

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1、定量PCR结合混合标本检测献血者HCVRNA【摘要】目的:探讨应用核酸扩增技术（NAT）定量检测献血者混合标本方法的可行性。方法：用荧光定量PCR法检测38例抗HCV阳性标本、3274例抗HCV阴性标本及二者随机抽样组成的混合标本的HCVRNA含量。结果：在38例抗HCV阳性标本中有15例核酸检测阳性,两者阳性符合率39.5%(15/38)。15例双阳性标本与抗HCV阴性标本混合检测核酸，仍为阳性。常规血清学检测阴性的标本NAT检测为阴性。结论:定量PCR检测HCVRNA的方法适用于献血者的筛查。【关键词】献血者丙型肝炎HCVRNA实时荧光定量PCR目前，全国血站

2、系统对献血者的血液检测已使用卫生部规定的血站基本要求的检测方法，对控制输血过程中丙型肝炎传染发挥了巨大的作用。但由于酶联免疫试验（ELISA）检测抗HCV的方法存在局限性，即检测“窗口期”长。据文献报道，使用PCR技术可以使丙型肝炎的窗口期缩短59d［1］。笔者采用定量PCR的方法对镇江地区无偿献血者的3312份标本进行HCVRNA检测，现将结果报告如下。　　1材料与方法　　1.1检测标本5　　镇江市中心血站无偿献血标本3312份，其中38例抗HCV阳性标本为2001年至2006年两种ELISA试剂检测抗HCV为阳性的标本，3274例抗HCV阴性标本为2007年1月至3

3、月街头无偿献血标本，离心后血浆-20℃保存。　　1.2试剂与仪器　　HCVAbELISA试剂盒(上海科华生物技术有限公司、厦门英科新创科技有限公司);HCVRNA荧光检测试剂盒(深圳匹基公司);ATplus2全自动加样仪及FAME全自动酶免分析系统(瑞士HAMILTON公司);LightCycler荧光定量PCR仪(Roche公司)等。　　1.3方法　　　　　　将38例抗HCV阳性标本直接按HCVRNA荧光检测试剂盒的说明进行检测；将3312标本编号随机以每24份作为一组，每份标本取20μl混成1份样品备检，共138份待检样品；剩余标本继续-20℃保存，对检出的阳性组，再

4、进行单独分检；基因拷贝数≥103/ml定为阳性。　　2结果538份抗HCV阳性标本荧光定量PCR法检测阳性数为15份，阳性率为39.5%。138份混合血浆样本荧光定量PCR法检测阳性数为13份，组别分别为3、7、36、45、46、66、89、96、99、109、112、121、130。对检出的13个阳性组，进行单独分检。结果除45、109组分别有两个阳性标本外，其余11组各有一个阳性标本，合计有15份阳性标本，对照单份标本所检测的15份阳性标本编号，结果一致。　　3讨论血源性传染病一直是困扰临床输血的一大难题。其原因是多种多样的，不可避免的“窗口期”是一个重要原因。就丙型肝炎的

5、输血感染风险度，国外报道为（1/10300）［2］,我国作局部调查为0.16%［3］。为了缩短丙肝的窗口期，在美国、德国等欧美发达国家已将核酸扩增技术(NAT)用于献血者的血液筛查。目前，我国还没有将NAT应用到血站系统的血液检测中，或未被我国卫生部列为血站系统必须开展的项目，是因为目前开展此技术的检测仪器、试剂费较高，为防止交叉感染，对实验室的洁净程度和试验人员的技术要求也比较高。为了减低检测费用，笔者认为采用混合样品进行检测是一个可取的方法［3］。国外的实验也证明了献血者血清转换前捐献血液未被混合PCR漏检，即病毒浓缩后PCR检测的灵敏度可达到103cp/ml～1045cp/

6、ml［4］，几乎可以关闭检测的窗口期。我们采用24份标本而不用太多标本混合的原因是在节约试剂的同时不会使混合标本的步骤过于复杂，发现阳性后对各个样本分别检测的工作量不至于非常大。综上所述，笔者认为在血站系统可以开展HBV、HCV病毒的定量PCR检测。在条件允许的情况下，逐步开展HIV病毒、梅毒的检测，最终做到在降低检测费用的基础上，进一步提高血液的安全性。【参考文献】　　［1］SchreiberGB,BuschMP,KleinmanSH,etal.Theriskoftransfusiontransmittedviralinfections［J］.EnglJMed,1996，334

7、:1685.　　［2］SaldhanaJ,MinorP.CollaborativestudytoassessthesuitabilityofaproposedworkingreagentforhumanparvovirusB19DNAdetecyioninplasmapoolsbygeneamplificationtechniques［J］.VoxSang,1997,73:207.　　［3］雷永良,纪勇平,吴丽雅.抗HCVELISA检测阴性献血者HCVRNA流行率调查［J］.