假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染

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1、假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染作者：裴斐，何蕊，李俊彦，余红【摘要】目的构建假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，并用于转染兔平滑肌细胞，为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体。方法构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，测定滴度，并转染兔平滑肌细胞，观察其转导效率。并与MuLV的转导效率进行比较。结果构建的MuLV/VSVG载体，病毒滴度为6～7.8×106CFU，转染兔平滑肌细胞的效率是(92±12)%。而MuLV的转导效率为(24±5)%。结论成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG载体，

2、该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染。【关键词】假型逆转录病毒载体；平滑肌细胞；转染　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructpseudotypedretroviralvectorMuLV/VSVGandtransferitintorabbitsmoothmusclecells(SMC)inordertoprovideahighefficiencyvectorforSMCgenetransfer.MethodsWeconstructedpseudotypedretroviralvectorMuLV/VSVGco

3、ntainingthepreviouslyreportedgenelacZ,determinedthetiter,anddeterminedtheefficiencyofgenetransferintoSMCmediatedbypseudotyped10retroviralvectorMuLV/VSVG.FinallythetransferefficiencywascomparedwiththatbyMuLV.ResultsMuLV/VSVGvectorwasconstructed.Thetiterofthevectorwas6-7.8×106C

4、FU,thetransferefficiencywas(92±12)%byusingMuLV/VSVGvectorand(24±5)%byMuLVvector.ConclusionPseudotypedretroviralvectorMuLV/VSVGwhichwasconstructedsuccessfullyisakindofhighefficiencygenetransfervectorinsmoothmusclecells.　　KEYWORDS:pseudotypedretroviralvector;smoothmusclecell;g

5、enetransfer　　基因治疗是指将具有防治潜能的外源基因，通过相应的载体转移到患者的有关组织器官和细胞内，获得适当的表达达到防治和减轻疾病的目的。其中目的基因载体的选择是基因治疗的关键之一。逆转录病毒是较常用的一种病毒载体。鼠白血病病毒MuLV衍生的逆转录病毒载体被广泛应用于将基因转染到哺乳细胞中并长期表达[1]。但该载体稳定性差，产生的病毒滴度低，转染到人类细胞效率低，并且只能转染分裂期细胞。VSVG，疱疹性口炎蛋白VSV的包膜蛋白，是一种单链蛋白，可以完全替代MuLV的env蛋白，产生基于MuLV的高转染率的病毒载体MuLV/VSVG，

6、已经被用来构建假型MuLV/VSV10G以提高MuLV载体的稳定性及转染效率[2]。本研究用兔平滑肌细胞作为靶细胞，观察MuLV/VSVG的转导效率，并与MuLV的转导效率进行比较，探讨MuLV/VSVG用于平滑肌细胞基因转染的可行性。　　1材料与方法　　1.1实验动物、试剂和仪器　　一月龄新西兰兔；小鼠成纤维细胞NIH3T3(美国迈阿密大学外科实验室)；DMEM培养基(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)；胰蛋白酶(Sigma公司)；多聚季胺(polybrene)储用液(8g/L)(Sigma公司)；G418储用液(

7、50g/L)(GIBCO/BRL)；CO2培养箱、无菌超净台、离心机、倒置显微镜。　　1.2细胞株和质粒　　人293T细胞、293/GPG包装细胞系由余红博士馈赠；pCnBgSN[3]是lacZ基因的表达质粒；质粒pHIT60[4]是鼠白血病逆转录病毒(murineleukemiaretrovirus,MuLV)Gag和Pol蛋白的表达质粒；质粒pCVG[2]是疱疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicularstomatitisvirusGglycoprotein,VSVG)的表达质粒。所有质粒由美国迈阿密大学外科实验室余红博士提供。所有质粒DNA均用大

8、肠杆菌DH5α感受态细胞(TIANGENBIOTECH)扩增，并用试剂盒(Valencia,10CA)从大肠