t细胞ctla-4、tcrvβ8基因克隆、重组及表达

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1、T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达作者：王晶，朱江，朱本章，马卫国【摘要】目的克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因，重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法RT-PCR从Graves’病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因，依次与表达质粒进行连接，双酶切及测序鉴定获得正确的重组子；原核表达融合蛋白，SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段，测序结果证实序

2、列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论成功构建和表达了CTLA-4－TCRVβ8基因，为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品【关键词】Graves’病；CTLA-4；TCRVβ；基因表达；融合蛋白　　ABSTRACT:ObjectiveTocloneCTLA-4andTCRVβ8genefromTlymphocyteofthyroidofGraves’disease(GD)patients,recombinetoformCTLA-4-TCRVβ8fusiongeneandexpressthefusionpr

3、otein.MethodsCTLA-4andTCRVβ8genewasclonedfromTlymphocyteofthyroidofGDpatientsbyRT-PCR.Thenitwas12recombinedwithexpressionplasmidinorder.ThecorrectplasmidswereobtainedaftertherestrictionanalysisandDNAsequencing.ProkaryoticexpressionofthefusionproteininE.coli,SDS-PAGEandWesternBlo

4、ttingwereusedtoverifythefusionprotein.ResultsRestrictionanalysisandDNAsequencingconfirmedthecorrectsequenceandinsertionsiteoftherecombinantplasmid.TherecombinantfusionproteinwassuccessfullyexpressedinE.coli,whichwasconsistentwiththepredictedputativecalculatingmolecularweight.Con

5、clusionCTLA-4-TCRVβ8genewasconstructedandexpressedsuccessfully,providinggeneproductandapplicationtheoryforimmunetolerancetherapyofGD.　　KEYWORDS:Graves’disease(GD);CTLA-4;TCRVβ8;geneexpression;fusionprotein　　Graves’病(Graves’disease,12GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病，是甲状腺功能亢进症中最常见的类型。自身免疫病的T细胞活

6、化需要双信号刺激，阻断第一信号则特异性免疫应答不能发生，阻断协同刺激信号，T细胞则进入无反应状态或发生凋亡。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是下调或终止T细胞反应的重要协同刺激分子［1］，CTLA-4Ig能有效阻断免疫反应，诱导免疫耐受，但缺乏特异性［2］。研究发现Graves’病患者甲状腺组织浸润T淋巴细胞为寡克隆性［3］，存在某些TCRVβ或TCRVα［4］基因家族亚型基因的优势利用现象，其中TCRVβ8为TCRVβ优势利用基因之一［5］。基因重组、表达CTLA-4-TCRVβ8融合蛋白，既利用TCRVβ8优势基因产物阻断TCR对特异性

7、抗原的识别，又利用CTLA-4阻断协同刺激信号，以达到同时阻断T细胞激活依赖的双信号作用，从而抑制或避免甲状腺特异性T细胞活化，来解决或部分解决CTLA-4诱导免疫耐受的特异性问题。本实验构建了pcDNA3.1(＋)-CTLA-4-TCRVβ8质粒，并在大肠杆菌中诱导其表达，初步验证了融合蛋白的生物活性。　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　pcDNA3.1(＋)、pET28a(＋)质粒由本校免疫病理教研室提供，Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自MBI公司，Taq酶购自Stratagene公司，dNTP购自Toyobo公司，各种

8、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，PCR引物由上海生工公司合成，质粒提取试剂