人b 淋巴细胞刺激因子体外活性分析

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1、人B淋巴细胞刺激因子体外活性分析【摘要】目的:分别采用MTT和ATPLiteTMM发光法分析人B细胞刺激因子对培养的小鼠脾细胞的生物学活性。方法:分离小鼠脾细胞,培养72h后,MTT和ATP方法测定不同密度脾细胞的增殖,从中选定适当的脾细胞密度分析BLyS活性。然后,检测不同剂量的BLyS对脾细胞的刺激作用。结果:用MTT和ATPLiteTMM发光法分析发现:BLyS在1、5、10和20mg/L时,都能明显促进小鼠脾细胞的增殖。结论:MTT法检测BLyS对小鼠脾细胞的增殖作用是一种简单、快捷的方法。利用这种细胞模型,可以对BLyS拮抗剂进行初步筛

2、选以期获得具有潜在应用价值的治疗剂。【关键词】B细胞刺激因子自身免疫性疾病ATPLiteTMB细胞MTT　　B淋巴细胞刺激因子(Blymphocytestimulator,BLyS)是TNF家族中的一员[1],又称为B细胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily,BAFF)[2],由单核细胞和巨噬细胞持续合成、分泌。BLyS以膜结合和可溶性两种形式存在。膜结合型BLyS由285个氨基酸组成,经蛋白酶水解膜外区的133～134氨基酸残基肽链后,可产生由152个氨基酸组成的可溶性活性多肽可溶性B

3、LyS(solubleBLyS,sBLyS),进入血液循环。在体内、外,7sBLyS均具有特异地刺激B细胞的作用,是B细胞发育、存活所必需的[3]。而过量表达BLyS与某些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)和口眼干燥综合征(Sjogrensyndrome,SS)等有关[4]。在这些疾病患者血清中,BLyS水平也明显升高[5,6]。目前,BLyS拮抗剂治疗SLE和RA正处在临床试验阶段,有望成为治疗SLE和RA的新方法。　　本研

4、究中采用MTT和ATPLiteTMM发光法,探讨了人BLyS对小鼠脾细胞的作用。这将为进一步寻找潜在BLyS的拮抗剂提供了初步筛选的简捷方法。　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供。可溶性BLyS(sBLyS)的原核表达载体及其空白质粒pET30a,E.coliBL21菌株由本室保存。镍螯合琼脂糖凝胶购自北京本元正阳基因技术股份有限公司。sBLyS的表达、纯化参照文献[7]报道。ATPLiteTMM发光法试剂盒购自PerkinElmerlifesciences公司。　　1.2方法7　　1.2.1小鼠脾细胞的制

5、备取4～6周龄的小鼠,脱臼处死后,泡于750mL/L乙醇中消毒。取出小鼠,放置平板上呈俯卧位。用镊子夹起左侧皮毛部,剪开皮肤、腹膜,分离脾脏,放置平皿中。轻柔剪去脾脏两侧系膜及周围组织,于平皿中加入1～2mL生理盐水,轻摇平皿洗涤。用平扁齿镊子轻挤压脾脏包膜,将脾脏细胞挤至平皿中,形成细胞悬液。预先于10mL试管中加入3mL小鼠淋巴细胞分离液,再沿管壁缓缓加入6mL细胞悬液,形成不同的液面层。2000r/min室温离心30min。轻轻环绕吸取界面细胞,加入生理盐水6～8mL,混匀、洗涤。1500r/min离心5min。弃上清,所得沉淀即为脾细胞。　　

6、1.2.2不同密度脾细胞增殖的分析调整脾细胞密度为1×109、2.5×109、5×109、1×1010和2×1010细胞/L,96孔板每孔分别加入100μL,于37℃、50mL/LCO2条件下培养72h。MTT法分析时,在培养终止前6h,加入5g/LMTT10μL,继续培养至72h,每孔加入100μL100g/L酸化SDS裂解细胞,于酶标仪ELISAreader读取A570值。ATPLiteTMM发光法参照生产商说明书操作。每孔加入50μL细胞裂解液,轻轻振摇5min;再每孔加入50μL底物溶液,轻轻振摇5min。光信号以每分钟计数(counts

7、persecond,CPS)为单位,于Wallace1420multilabelcounterVICTOR3(PerkinElmer,Singapore)仪测量。　　1.2.3BLyS对脾细胞作用的分析7每孔加入固定密度的脾细胞。再分别加入不同浓度的BLyS。以pET30a空载体表达的74个氨基酸组成肽作为对照。于37℃、50mL/LCO2条件下培养72h。同1.2.2,MTT和ATPLiteTMM发光法测细胞增殖。刺激指数(Stimulatingindex,SI)分别按以下公式计算:MTT法SI=(实验组A570－细胞本底A570)/细胞本底A

8、570;ATPLiteTMM发光法SI=(实验组CPS－细胞本底CPS)/细胞本底CPS。　　2结果　　2