人αsynuclein突变体的克隆及细菌表面展示

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1、人αsynuclein突变体的克隆及细菌表面展示作者：熊莉丽赵鹏郭志云张建华茆灿泉【摘要】目的在细菌表面构建及展示人αsynuclein突变体A30P、E46K和A53T。方法采用叠套PCR介导的点突变方法，以野生型αsynuclein为模板。结果成功克隆了αsynucleinA30P、E46K和A53T3个突变型基因，并利用细菌亲密素展示系统将野生型αsynuclein及突变体A30P、E46K和A53T成功展示在大肠杆菌表面。结论αsynuclein及其突变体的细菌表面展示对于αsynuclein空间结构的良好保持和基于αsynuc

2、lein神经退行性疾病靶分子药物、分子诊断试剂的研发和αsynuclein蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。【关键词】αsynuclein;突变体;生物信息;叠套PCR　　【Abstract】ObjectiveToanalyzebioinformaticsanddisplayofhumanαsynucleinmutantsofA30P,E46KandA53TproteinsonthecellsurfaceofEscherichiacoli.MethodsOverlapextensionPCR,arapidandefficientmeth

3、odbysitedirectedmutagenesiswasintroducedtoclonethemutantsA30P,E46K,A53Tofαsynuclein.ResultsAllthethreecloned13mutants,includingthewildtypeofαsynuclein,weresuccessfullydisplayedonthesurfaceofE.colistrainsbasedontheEnterohemorrhagicE.coliIntiminEaeA.ConclusionsTheworkwouldbeofg

4、reatconsequenceandvaluesforthebettermaintainingofthespatialstructureofαsynucleinandfurthertargeteddrugdiscovery,moleculardiagnosticreagentsdevelopmentforneurodegenerationdiseasesaswellforthestudyofitsproteinstructureandfunctions.　　【Keywords】αsynuclein;Mutant;Display;Bioinforma

5、tics;OverlapextensionPCR　　Synuclein基因是1988年由Maroteaux教授在电鳗鱼中发现的〔1〕，到目前为止已在人、鼠、兔等多种脊椎动物中发现存在，主要分为αsynuclein、βsynuclein和γsynuclein3大类。其中αsynuclein是一类广泛分布于神经中枢系统中的可溶性小蛋白，与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关〔2〕。αsynuclein蛋白主要在神经组织中大量表达，是帕金森病中出现的路易小体的主要组成部分，主要通过蛋白的聚集状态〔3〕、泛素化〔4〕和磷酸化〔5〕等途径来调

6、节其生物活性和生理功能。研究表明α13synuclein蛋白有分子伴侣的活性〔6〕，在神经递质和多巴胺递质的释放、囊泡运输及调节蛋白酶体活性等方面起着重要的作用〔7〕。Polymeropolos等〔8〕、Kruger等〔9〕和Zarranz等〔10〕分别于1997、1998和2004年在家族性帕金森病遗传家族中发现了A53T、A30P和E46K3个错义突变蛋白，突变蛋白的表达会导致αsynuclein蛋白的异常聚集，形成具有疏水性的寡聚体，表现出较强的细胞毒性，这与帕金森病的发病有着密切的关系〔11〕，但这3个突变基因分布在不同帕金森遗传病家族中，

7、较难直接克隆得到。本文在生物信息分析的基础上，首先利用PCR介导的点突变技术，以αsynuclein野生型基因为模板，克隆了A30P、E46K和A53T3个突变基因，然后结合细菌展示技术，将野生型αsynuclein与突变体A30P、E46K和A53T展示于大肠杆菌表面。αsynuclein在细菌表面的成功展示对于αsynuclein空间结构的良好保持和基于αsynuclein的神经退行性疾病靶向药物、分子诊断试剂的研发和蛋白结构与功能的研究等具有重要的意义和价值。　　1材料与方法　　1.1质粒与菌株野生型αsynuclein基因由美国哈佛

8、医学院的Yankner教授馈赠;细菌亲密素展示载体paskint100由德国Christma