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1、细菌视紫红质基因的克隆及鉴定论文学号:20080403801022武汉东湖学院生物技术综合实验论文细菌视紫红质基因的克隆及鉴定院系:生命科学与化学学院姓名:付锴专业:08级生物技术指导老师:金卫华、邓丽娟、涂毅二?一一年五月摘要本实验室通过将视紫红质目的基因(即bop基因)导入pUC18质粒制备得到重组质粒,再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定,初步证实该实验实现了视紫红质目的基因(即bop基因)的克隆。本次实验,通过老师提供的大肠杆菌DH5α(含pUC18质粒)菌种平板和大肠杆菌DH5α(不含pUC18质粒)菌种平板
2、进行接种后对比,在氨苄青霉素选择性培养基的筛选作用下,得到了含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α;通过SDS碱裂解法制备得到了pUC18质粒,并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定;以实验室老师所提供质粒为模板,进行PCR扩增得到目的基因(带BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点),并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化;在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,得到酶切后的pUC18质粒和目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化;在T4DNA连接酶的连接作用下,制备出重组质粒;通过氯化钙制备得到感受态大肠杆菌DH5α细胞;在42℃短时间的热冲击处理(热休克)下,重组质粒被
3、感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取,随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆;为了鉴定重组质粒确实含有视紫红质目的基因(即bop基因),并确实被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取,并随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆。首先通过SDS碱裂解法提取重组质粒;通过以重组质粒为模板,PCR扩增得到目的基因;然后在1%琼脂糖凝胶电泳中,通过与Maker蛋白的电泳条带对比,进行初步鉴定,得出我们所提取的重组质粒中含有视紫红质目的基因(即bop基因)。为了进一步确定结果,在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,我们对重组质粒进行酶切;在琼脂糖凝胶电泳中,通过与Maker
4、蛋白的电泳条带对比,进一步确认出,我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒,确实就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒。本次实验的结果:(1)第一次碱裂解法提取质粒后电泳鉴定时,只得到了一条不成带形的“脱尾”亮带,所处位置大致在1.5~2.0kb,推测出这段亮带是不完整的被打断的质粒;第二次碱裂解提取质粒后电泳鉴定时,根据亮带所处位置,其碱基数在1.9kb左右,推测出闭合环状的pUC18质粒。(2)PCR扩增得到的目的条带,碱基数在1.2kb左右,亮度较大,带形较宽且连续,推测出该条带是扩增产物,且浓度较大并且纯度较高;在该目的条带下方,出现了
5、模糊的涂抹带,推测出该条带可能是PCR非特异产物带;在碱基数为110bp左右,出现一条模糊带,推测出该条带可能是“引物多聚体”带,也可能是非特异性序列带。(3)经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ处理后,电泳只得到了一条亮带,且亮带处于2.1kb左右,即推测为pUC18质粒。(4)通过SDS碱裂解法提取质粒,电泳只得到一条亮带,碱基数在2.2kb左右,推断是重组质粒;通过以重组质粒为模板,PCR扩增电泳得到一条亮带,碱基数在1.2kb左右,推断是目的基因;有“彗星”尾出现,推断是由于没有加入RNA酶。(5)酶切之后的产物出现两条亮带,根据开环pUC18质粒
6、碱基数在2.1kb左右,酶切后的目的基因碱基数在1.1kb左右,并与酶切之前的重组质粒亮带对比,推测出上面一条带是开环pUC18质粒,下面一条带是酶切后的目的基因。本次实验的结论:我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒,初步确认就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒;有关视紫红质目的基因的性状表达,应做进一步的实验鉴定。关键词:视紫红质基因;pUC18质粒;基因克隆;大肠杆菌DH5α目录摘要11.前言31.1基因工程技术31.1.1基因工程的建立与基本概念31.1.2基因工程的四大要素31.1.3基因工程的应用进展41.2PCR技术41.3细
7、菌视紫红质基因的结构功能与应用51.4实验原理51.4.1SDS碱裂解法制备质粒及电泳鉴定51.4.2感受态细胞的制备61.4.3转化子的筛选6整个基因重组试验的基本流程图72.材料和方法82.1培养基配制、灭菌、无菌接种82.1.1实验器材和试剂82.1.2实验方法82.2SDS碱裂解法制备质粒及电泳鉴定82.2.1实验器材和试剂82.2.2实验方法92.3PCR扩增目的基因及电泳鉴定102.3.1实验器材和试剂102.3.2实验方法102.4PCR产物电泳及回收纯化102.4.1实验器材和试剂102.4.2实验方法112.5质粒和目的基因PCR产物的酶
8、切及纯化112.5.1实验器材和试剂112.5.2实验方法112.
