人αSYNUCLEIN及其突变体的克隆、细菌表面展示与筛选

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1、西南交通大学硕士学位论文人α-synuclein及其突变体的克隆、细菌表面展示与筛选姓名：熊莉丽申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：茆灿泉20090501西南交通大学硕士研究生学位论文第

2、I页a-synuclein、13-synuclein和7一synuclein基因相比则表现出较远的距离。通过生物信息学分析发现人类(It．synuclein蛋白可以从序列上分为3个区域：N端(1．60)的两性Q螺旋区，主要包括膜结合区和疏水性NAC区，主要由6个“KTKEGV"非完全重复序列组成；中间NAC(61．95)区域表现出较强的疏水性；C端(96．140)则主要由酸性氨基酸组成

3、。a-synuclein突变体A30P、E46K和A53T的突变位点位于伐一synuclein基因的不同外显子上。突变体A30P的88位突变碱基位于外显子2上；而突变体E46K和A53T的突变位点则位于外显子3。0【．synuclein外显子的异位拼接产生4种异构体。5个外显子都参与编码一个由140个氨基酸组成的14．5kDa的蛋白，这是0【．synuclein在人体内存在的主要形式；同时外显子3和5在体内存在选择性剪接的机制，外显子3或5的缺失，分别形成与140个氨基酸0【．synucleinN框的126个氨基酸(13．1kDa)，112个氨基酸(11．4kDa)的剪接变体；而外显子3

4、和5的同时缺失则形成一个只编码98个氨基酸的Q—synuclein。其次，采用叠套PCR介导的点突变方法和连接方法，以野生型Q．synuclein为模板，成功获得了a．synucleinA30P、E46K和A53T3个突变型基因以及ct-synuclein剪接变体98，112和126。第三，以GFP为模型蛋白通过paskinl00重组质粒的构建和细菌表面展示、GFP蛋白诱导表达和绿色荧光显示确认细菌亲密素展示系统的正确性。在此基础上将野生型0【．synuclein及突变体A30P、E46K和A53T成功展示在大肠杆菌的细胞表面，SDS．PAGE凝胶电泳和WesternBlot检测到外源Q

5、．synuclein蛋白目的带的高效表达。第四，利用展示在大肠杆菌表面a．synuclein筛选噬菌体随机12肽库，筛选与Q．synuclein高度亲和的特异性短肽，经前两轮的筛选，已收获与a．synuclein结合的噬菌体肽库，正用于进一步的筛选和富集。综上，通过本研究得到如下初步结论：1)synuclein直系同源基因西南交通大学硕士研究生学位论文第1II页0【。synuclein、I$-synuclein和丫．synuclein基因表现为较近的亲缘关系，而相同物种由基因复制产生的旁系同源基因Q、p和丫．synuclein贝．1J表现出较远的距离：2)生物信息学分析发现人0【．syn

6、uclein蛋白从序列上可分为3个区域：N端(1．60)的两性Q螺旋区；中间NAC(61．95)区；C端(96．140)；3)突变体A30P、E46K和A53T的突变位点位于不同的0【．synuclein基因的外显子上；4)外显子3或5的缺失，分别形成与140个氨基酸a-synucleinM框的126个氨基酸(13．1kDa)，112个氨基酸(11．4kDa)的剪接变体，而外显子3和5的同时缺失则形成一个只编码98个氨基酸的a-synuclein。不同突变和剪接形式的0【．synuclein对Q．synuclem蛋白的聚集速度存在一定的影响；5)通过叠套PCR介导的点突变和连接方法成功克

7、隆Q．synuclein突变型基因A30P、E46K和A53T及剪接变体98，112和126：6)通过GFP重组质粒的构建和细菌表面展示确认了细菌亲密素展示系统的正确性，实现了c【．synuclein及其突变体的细菌表面展示并直接用于噬菌体随机肽库的筛选。本工作对基于o【．synuclein及其突变体靶分子结合肽的获得和帕金森病等神经退行性疾病的研究和治疗均具有重要的意义和价值。关键词：a-synuclein，突变体，细菌表面展示，噬菌体肽库，筛选；西南交通大学硕士研究生学位论文第lV页AbstractParkinson’Sdisease(PD)isadegenerativediseas

8、e，whichcausedtremorinrest,musclerigidityandhypokinesia．a-synuclein，amemberofsynucleinfamily,is140aminoacidslonginhuman，andthegeneisorganizedas6exons，5ofwhichareprotein—coding．TheQ—synucleinproteinsarepredominatelyexpre