Loxp突变体的筛选与应用.pdf

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1、高技术通讯2004.llLoxp突变体的筛选与应用!刘维一!汪亚平朱作言"（中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430072）摘要Cre/loxp系统已成功应用于多种生物的遗传改造，并成为研究基因功能的有力工具之一。由于野生型loxp之间重组反应的可逆性，Cre/loxp系统在基因激活/灭活、基因打靶、基因精细修饰等方面的应用受到了极大的限制，而loxp突变体的出现解决了这一难题。本文就loxp突变体的筛选与应用作了系统全面的介绍。关键词Cre/loxp，loxp突变体，基因打靶内外重组反应分析表明，相对于野生型loxp而言，0引言lo

2、x7l和lox66被Cre识别的效率有所提高，而lox75，Cre/loxp系统是源于大肠杆菌Pl噬菌体的一lox76，lox44以及lox43被Cre重组酶识别的效率大个位点特异性重组体系［l］。Cre重组酶所识别并催大下降，故Lox7l和lox66可以作为一对理想的左右化的特定DNA序列称为loxp（locusofcrossoverxin突变体应用于基因打靶研究中。Pl），包含两个l3bp的反向重复序列和一个Sbp的1.2中心（spacer）突变体间隔序列（spacerregion），这个非对称的Sbp间隔区为了研究loxp间隔序列在重组反应中的作用，决定

3、着loxp的方向［l，2］。Cre/loxp系统在基因功能［9］人工合成了24个单碱基替换和30个双碱基Lee等鉴定、染色体易位和删除、转植基因在生殖细胞中的替换的中心突变体。然后利用纯化的Cre重组酶在删除等方面应用非常广泛［3-7］。由于Cre重组酶催体外分别试验这54个中心突变体与野生型loxp之间化两个野生型loxp之间的重组反应是可逆的，最终的重组效率，以及它们自身发生重组反应的效率。结重组反应达到一个动态平衡［S］，当野生型loxp应用果发现间隔序列Sbp中的第l和第S个碱基发生改于外源基因定点整合、基因捕获、基因精细修饰等研变后不太影响重组反应的

4、效率，而其他绝大多数中心究时，重组效率常常很低，而loxp突变体的出现则突变体不与野生型loxp发生重组，表明间隔序列Sbp为解决这一难题提供了有力工具。中的第2到第7个碱基在重组反应中起到了决定性lLoxp突变体的筛选的作用。这个实验结果也在一定程度上支持了Guo等提出的关于Cre/loxp重组反应的~olliday模型［l0-l2］：1.1左右（LE/RE）突变体间隔序列的第7个碱基影响着第一步链的断裂，间隔Albert等根据FRT突变体的原理设计了3对序列的第3~6个碱基影响着~olliday异构化时链交loxp突变体：lox7l和lox66、lox75

5、和lox76、lox44和［S］换的进行，间隔序列的第2个碱基影响着第二步链的lox43。其中在左边l3bp重复序列发生突变的断裂。在单碱基替换的中心突变体与野生型loxp重loxp称为LE突变体，右边l3bp重复序列发生突变组实验中，绝大多数反应因为形成中间体（intermedi-的loxp称为RE突变体。LE突变体（lox7l，lox75，ate）而不能进行到底，真正重组反应效率低下的中心lox44）和对应的RE突变体（lox66，lox76，lox43）发生突变体自身重组反应又很低，只有突变体7l（lox5ll）重组后形成双突变loxp与野生型既不与lo

6、xp发生重组，自身重组效率也还可以，能够loxp，而双突变loxp被Cre重组酶识用于基因打靶研究。在双碱基替换的中心突变体与别的效率大大减小，所以双突变野生型loxp重组实验中，绝大多数重组反应完全不能loxp与野生型loxp发生重组的效率进行；在这个前提下，自身的重组效率较高（>50%）极低，重组反应主要表现为正向（图的中心突变体有lox227l，lox3l7l，lox5l7l，lox527l，l）。通过短暂提供Cre重组酶的体#S63计划（2002AA6290l0，2004AA2l3l2l）和国家自然科学基金（30l30050）资助项目。!男，l9S0年

7、生，硕士生；研究方向：发育与分子遗传学。"联系人。（收稿日期：2004-04-l9）—l02—刘维一等：Loxp突变体的筛选与应用lox2272和lox5372，所以这6个双碱基替换的中心突变体也可以用于置换型基因打靶载体的设计。X表示重组反应，箭头指向代表反应方向，箭头长度代表反应效率图1Loxp重组反应效果图此后，Siegel等［l3］分析了5个中心突变体在组成性表达Cre的细胞系中的重组效率。其中lox5ll2Loxp突变体的应用与Lee实验中的单碱基突变体7l序列相同，lox5ll-I2.1单lox基因打靶策略是lox5ll间隔序列倒置后的突变体lox

8、p，FASloxp是［l5］利用野生型