稻瘟菌REMI突变体库的构建及AVRPia的克隆

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1、中国农业大学博士学位论文稻瘟菌REMI突变体库的构建及AVR-Pia的克隆姓名：魏士平申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：彭友良2002.6.1中文摘要稻瘟菌(肘妇”q∞r胁P∥妇∞)可侵染多种禾本科植物，是引起水稻稻瘟病的病原真菌。Mgrisen与水稻间的相互作用符合基因对基因关系，现已作为模式系统之一来研究植物病原真菌与植物的互作机理。研究Mgrisea的致病性及其变异的分子机理对r控制稻瘟病具有重要应用意义。经过许多学者的大量研究和努力，现己确定稻瘟菌的基冈组有7条染色体，约含38～40Mb；并己建立了稻瘟菌的

2、遗传图谱和部分染色体的物理幽谱。稻瘟菌基闪组的全序列测定和EST测序亦正在进行之中，这些预示着稻瘟菌功能基因组研究已经开始。为了确定每个基因的功能，建立插入突变体库是十分必要的，这也是功能基因组研究的一个重要方面。本研究利用限制性内切酶介导的方法，采用鳓l、Hindlll、Sacl和Sma

3、分别线性化的pUCATPH转化了膨griseaPl31小种，分别获得了2973、3685、2883和2804共12345个转化体。为分析质粒整合特性，从上述限制性内切酶介导转化所得到的转化体中各随机，抽取17个转化体，进行了基因组Sout

4、hern分析。皓果显示，所有68个转化体杂交带型均＼不相同，表明转化用质粒在稻瘟菌基因组中的整合位点不同。对上述转化体中的9406个转化体进行的初步筛选，得到了37个形态与致病性变异的突变体，从中抽取12个进行了遗传杂交分析，结果表明，75％的突变体的突变表型与插入质粒(HygB+)是共分离的。因此，本研究所构建的突变体库可为稻瘟菌功能基因组研究提供丰富的突变体选择。为了克隆功能基因，作者在本研究中还以野生型稻瘟菌菌株Y34为材料．构建了一个包含16128个克隆的稻瘟菌基因组的TAC文库。随机挑取100个克隆进行酶切分析，结

5、果表明：74％的克隆含有外源插入片段，其插入片段大小平均为59kb。由此，作者推测：此基因组文库相当于稻瘟菌基因组的18倍。进一步作者采用三个单拷贝的标记做为探针筛选该文库，分别得到16、17和16个阳性克隆，此结果确认了该库的覆盖率。从MHl8S1为探针所筛选的阳性克隆中，随机挑取8个并对其进行了限制性酶切分析，结果表明：其组成的重叠群跨度为153kb，未发现嵌合和缺失现象。因此，作者认为：该TAC文库适台删＼于稻瘟菌基因组的分析。扩、一-本研究的一个重要组成部分是作者对从8acl介导的转化群体中筛选得到一株对水稻品V种爱

6、知旭(含有抗病基因Pia)特异性发生改变了的突变体MS220进行分子遗传学分析。f以插入载体为探针进行的基冈组Southern杂交分析表明：质粒在该突变体基网组中的插入＼为单位点反向串联插入。通过plasmidrescue方法，分别得到两种质粒Ms220K1和MS220K4(Kpnlrescued)或MS220H2和MS220H3(Hindlllrescued)。无毒基冈的缺失、点突变及转座子的插入，均能造成其功能的丧失。一般来说，毒性菌株和无毒菌株在无毒基因位点应能检测到其多态性。为了确认MS220中由于外源质粒的插入所破

7、坏的基因在毒性菌株和无毒菌株之间是否也存在多态性，分别以MS220K4和M2220H3的侧端序列为探针，对P131、J110(对爱知旭表现为无毒性菌株)和S1528、J144(对爱知旭表现为毒性菌株)进行了多态性分析，结果表明，当以MS220K4侧端序列为探针时，无毒菌株和毒性菌株之间在Sacl酶切的泳道内出现了多态性，因此可以推测，P131内对应爱知旭抗病基因Pia的无毒基因确已被pUCATPH标记上。为克隆AVR-Pia基因。以MS220K4的侧端序列为探针筛选稻瘟菌基因组TAC文库，得到17个阳性克隆，通过对其中lo个

8、进行的限制性内切酶分析并结合Southern杂交确定了目的基因(AVR-Pia)所在区域。核苷酸序列测定结果于GENSCAN软件分析表明，AVR．

9、P妇全长9546bp，包含一个内含子和两个外显子，该基因编码一个含1994个氨基酸的蛋白质；进一步的BLAST检索发现：AVR-Pia的编码产物与Neurosporecrassa中的葡萄糖苷．a-1，4．葡萄糖苷酶相关蛋白同源，两者的一致性达37．87％。作者还构建了该基因的disruption、，载体，利用同源重组的方法转化P13I，并通过致病性检测确认了该无毒基因。l／√／关

10、键词，稻瘟菌突变停库TAC亥库无毒基因VIAbstractMagnaporthegrisea，whichCallinfectmanygrasses，isthepathogenicfunguscausingriceblastdisease．InteractionsofracesofMgris