人胚肺间充质干细胞对放射性肺炎肺组织损伤的修复作用

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1、人胚肺间充质干细胞对放射性肺炎肺组织损伤的修复作用【摘要】目的研究人胚肺间充质干细胞(MSC)对放射性肺炎肺组织的修复作用。方法取3～5个月的流产胎儿，按照人骨髓MSC的体外培养方法，获得贴壁的人胚肺细胞，观察其形态、细胞周期和体外诱导分化潜能。通过培养放射性肺炎肺泡上皮细胞，利用细胞培养技术体外测定人胚肺MSC修复放射损伤肺组织的能力，对比检测实验及对照组TGFβ1的含量。结果人胚肺MSC可在体外扩增培养，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于G0/G1期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点。其免疫表型与骨髓来源的MSC相似，并能有效调控放射性损伤后的肺泡上皮的生长。

2、结论人胚肺MSC能有效修促进肺泡上皮细胞的生长，且能对放射性损伤后肺上皮细胞进行修复。【关键词】人胚胎肺;间充质干细胞;放射性肺炎10放射性肺损伤是最为常见和严重的胸部放疗并发症之一，其高发病率限制了肿瘤的放疗剂量，从而使肿瘤治疗疗效下降，部分重度放射性肺损伤明显增加了患者的死亡风险。因此积极寻找能够预防、逆转和治疗放射性肺损伤并且副作用小的治疗方法成为非常重要的课题。人们在许多组织和器官中都发现和分离了具有多分化潜能的相应干细胞，但在肺组织证实和分离肺干细胞的研究进展缓慢，呼吸道黏膜上皮及肺泡上皮细胞终生不断自我更新，尤其在肺组织严重损伤以后，上皮更新，促进创伤修复，在理论上肯定存在

3、多能干细胞，人们用同位素标记的方法取得了一些肺干细胞存在的证据，肺泡上皮Ⅱ型细胞中可能存在具有干细胞特征的细胞类型。本研究通过对人胚肺MSC分离、传代培养、生物学特性及多向分化能力的测定，明确了人胚肺MSC的干细胞特性。通过动物体内实验及体外细胞培养试验，证实了人胚肺MSC能有效促进肺泡上皮细胞的生长，且能对放射性损伤后肺上皮细胞进行修复〔1，2〕。　　1材料与方法　　1.1MSC的分离和培养选取15例水囊引产胎儿，胎龄为3～5个月。取胎儿肺脏，用DHanks液反复冲洗，剪成碎块，用0.2%Ⅱ型胶原酶(Sigma)消化，37℃、30min，过100目钢网，制成单细胞悬液，细胞密度为2

4、×106/ml，用含DMEM/F12，MCDB201，2%FCS(GibcoBRL公司)培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养，3d后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达80%～90%融合时，0.25%胰酶(Sigma)常规消化传代。　　1.2细胞形态学观察及细胞周期的测定　　1.2.1细胞形态学观察10取1～7代MSC，置于有小玻片的3.5cm直径平皿中，37℃，饱和湿度，5%CO2培养12d后取出，空气风干，瑞士染色，油镜下观察细胞形态。　　1.2.2细胞周期的测定MSC细胞周期分析的主要试剂：RNA酶I(TaKaRa)，碘化丙啶(PI，Sigma)。将胎儿MSC

5、消化，70%冷乙醇4℃固定30min，PBS液洗涤细胞2遍，5μg/mlI染色(室温，5min)，用流式细胞仪(FACSVantage型)检测，ModFIT软件分析结果。用流式细胞仪测定第11、15代MSC的DNA含量，可见处于G0/G1期的细胞多，分别为95.34%、95.68%，S期少，分别为4.13%、3.58%。　　1.3免疫组化及PTPCR方法检测人胚肺MSC向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化能力　　1.3.1人胚肺MSC的一般生物学特性单个核细胞培养48～72h后，在镜下可见散在的贴壁细胞，呈典型纺锤样成纤维细胞状，7～10d形成放射状克隆，挑出20个克隆分别培养，约1w形成致

6、密的贴壁细胞层，细胞形态均一，生长速度快，易被胰酶消化，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变。以下描述中将此类细胞称为人胚肺贴壁细胞(fetallungderivedadherentcell，FLAC)，见图1。　　1.3.2MSC多系诱导分化的鉴定10FLAC在成脂肪诱导体系中培养3d，细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短，成为立方形或多角形。连续培养7d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合。培养2w时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，诱导2周期后用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异的染成红色，见图2B。上述细胞同时表达脂肪细胞特异性的PPAR

7、γ2。成骨培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照中细胞仍是梭形且呈单层生长;80%～90%的细胞呈Apase阳性，而对照中的Apase阳性细胞较少;vonKossa染色发现在成骨培养有明显的钙化基质沉积，而对照中未见到此现象;RTPCR分析表明MSC经OS诱导分化培养后表达骨钙蛋白基因，见图2C。　　1.4放射性肺炎肺泡上皮细胞的培养2BS细胞条件培养液的获取：(1)条件培养基1的制备：