丙酮酸对过氧化氢诱发pc12细胞损伤的保护作用

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1、丙酮酸对过氧化氢诱发PC12细胞损伤的保护作用作者：安丽荣郭艳芹金连弘傅松斌【摘要】目的研究丙酮酸对过氧化氢(H2O2)诱发小鼠嗜铬细胞瘤瘤细胞（PC12细胞）损伤的保护作用并初步探讨其保护机制。方法将培养的PC12细胞分为三组：正常对照组；损伤组；保护组，在用H2O2处理前30min加入丙酮酸。通过细胞形态学方法，化学比色法测定琥珀酸脱氢酶(MTT)含量，乳酸脱氢酶(LDH)释放量，超氧化物歧化酶(SOD)含量和丙二醛(MDA)含量，观察丙酮酸的神经保护作用。结果通过形态学方法，保护组细胞数显著比损

2、伤组多，受损变圆的细胞数较少。保护组可明显降低细胞LDH释放量和细胞内的MDA含量(P＜0.01)；提高MTT测定值和SOD活性。结论丙酮酸对H2O2诱发PC12细胞损伤有显著的保护作用。【关键词】PC12细胞；丙酮酸；H2O28近年实验证明丙酮酸能预防由氧化应激引起的内皮细胞的凋亡〔1〕，在心脏再灌注损伤和急性肾衰竭中具有保护机体抗损伤作用〔2〕。目前尚无报道在PC12细胞上研究丙酮酸抗氧化和抗自由基作用。本文以H2O2损伤的PC12细胞为模型，研究丙酮酸是否有抗氧化的神经保护作用，从而为深入研究丙

3、酮酸的抗氧化机制及Alzheimer(AD)病的治疗提供有意义的药物学依据。1材料与方法1.1实验样品PC12细胞，购自上海细胞生物所细胞库。1.2试剂MTT、NADH购自Sigma公司，DMEM培养基、胎牛血清、马血清蛋白等，购于Hyclone公司，其他试剂，均为国产分析纯。乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所。1.3仪器高速冷冻离心机（HITACHI20PR520，日本），紫外可见分光光度计（PERKEN

4、ELMERLambda17，西德），倒置显微镜（OLYMPUSDP10，日本），二氧化碳孵箱（REVCO/LINDBERGRCO3000TVBB，美国），BCM100型生物洁净工作台(苏净集团安苏空气技术有限公司)，酶标仪（BIORADModel550，日本）。1.4细胞培养和预处理在37℃，5%CO2孵箱内培养PC12细胞，DMEM培养基中含10%马血清和5%胎牛血清，加入100μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2～38d传代1次，取生长期细胞用于实验。将细

5、胞分为三组：正常对照组，常规加入培养液；损伤组，同时加入培养液和H2O2，H2O2终浓度为200μmol/L；保护组，加入培养液和丙酮酸30min后，再加入H2O2，丙酮酸终浓度分别为5、10、20mmol/L，H2O2终浓度为200μmol/L。1.5MTT方法细胞以1×104/孔的接种量接种于96孔培养板上。同上分组，每组7孔。37℃孵育过夜后，弃去培养液。进行如上预处理。H2O2组孵育10h后弃去药液及培养液，每孔加入MTT(5g/L)25μl（取MTT100mg，用高压灭菌的PBS配制成5g/

6、L贮存液20ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光可以保存2w）。1.6PC12细胞LDH释放量的检测取细胞上清液10μl，按照LDH测定试剂盒说明书操作，检测PC12细胞培养液中LDH含量。酶活性单位以U／ml表示。1.7PC12细胞内SOD和MDA含量测定吸去培养液，冰生理盐水洗涤细胞2次，用塑料细胞刮子刮下细胞，冰生理盐水收集，冰浴中用超声细胞破碎仪破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，分别取100μl按SOD及MDA测定试剂盒说明书操作，比色法测定PC12细胞内SOD及MD

7、A的A值并计算其活性。其活性单位以U／mg表示。1.8统计学分析采用SPSS10.0软件处理，数据以x±s表示,采用方差分析检验方法对数据进行统计。82结果2.1形态学观察显微镜下可见正常对照组细胞形态呈梭形或多角形，细胞数量多。损伤组细胞数量显著减少，部分细胞形态正常，呈梭形或多角形，部分细胞损伤呈圆形。保护组细胞数量增多，大多数呈梭形或多角形，极少数细胞损伤，呈圆形。见图1。图1各组细胞显微照像比较（×200）2.2MTT实验正常对照组测定MTTOD值为0.107±0.0101，损伤组为0.028

8、±0.0028，与正常对照组相比显著降低(P＜0.01)，说明损伤组细胞的琥珀酸脱氢酶(MTT)活性低，活细胞数较少。丙酮酸5、10、20μmol/L组MTTOD值分别为0.078±0.0041，0.085±0.0048，0.091±0.0063；与损伤组相比显著升高(P＜0.01)。说明丙酮酸各浓度组MTT的活性高，活细胞数增多，丙酮酸具有保护作用。2.3LDH、SOD和MDA的检测8损伤组细胞上清液LDH活性增大(P＜0.01)，说明细胞膜损伤严重，