γ-氨基丁酸对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠认知功能的影响

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1、γ-氨基丁酸对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠认知功能的影响【摘要】目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆功能及海马谷氨酸含量、GABA受体表达的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、GABA组。采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立VD模型。GABA组术后腹腔注射GABA0.5g·kg-1·d-1，连续注射60d。Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆行为;生物化学法测定各组大鼠海　　马谷氨酸含量，免疫组化法观察大鼠海马CA1区GABA受体表达的变化。结果模型组大鼠存在明显的学习记忆功能障碍，与模型组比较，GABA组的学习记忆功能明显提高

2、(P<0.05)，同时，其海马谷氨酸含量明显降低(P<0.01)，CA1区GABA受　　体表达明显增加(P<0.01)。结论GABA可以改善慢性脑缺血致VD大鼠的学习记忆功能，增加海马GABA受体表达，拮抗谷氨酸兴奋性毒性可能是其机制之一。【关键词】血管性痴呆;γ-氨基丁酸;学习记忆;GABA受体;谷氨酸;Morris水迷宫　血管性痴呆(VD)是指由于各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征。在各种脑血管疾病中缺血性脑血管病的发病率最高，也是VD最主要的致病因素〔1，2〕。γ9-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布

3、的重要的抑制性神经递质，约50%的中枢突触部位以GABA为递质〔3〕。在脑缺血时，GABA通过突触后、突触前抑制作用，拮抗谷氨酸的兴奋性毒性，减轻细胞损伤，有显著的神经保护作用〔4〕。但在脑缺血持续的病理损伤过程中，GABA的合成会被关闭，继之逐渐耗竭〔5〕，补充GABA对慢性脑缺血所致的VD是否产生影响尚不明确。本文观察了GABA对VD大鼠学习记忆功能及海马谷氨酸含量、GABA受体表达的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物和分组健康雄性SD大鼠，体重(200±20)g，南通大学医学院实验动物中心提供。大鼠适应性喂养3d后，置于Morris水迷宫中

4、学习训练2d，于第3天选择4次均在90s内找到平台的大鼠为合格实验大鼠，筛选出36只合格大鼠，按照随机原则分为3组：假手术组、模型组、GABA组，每组12只。　　1.1.2主要仪器和试剂Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所;原料粉剂：美国Sigma公司，纯度为99%;兔抗GABA多克隆抗体：上海麦莎生物有限公司;谷氨酸及总蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所。9　　1.2方法　　1.2.1VD动物模型制作用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备慢性脑缺血大鼠模型。大鼠仰卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，腹侧颈正中切

5、口，分离双侧颈总动脉，4号手术丝线双结扎双侧颈总动脉，于远近结扎点间剪断动脉，确保阻断颈总动脉血流，缝合切口。　　1.2.2给药方法及剂量GABA组大鼠于模型制备完成后按0.5g·kg-1·d-1给予GABA(生理盐水稀释成1ml)腹腔内注射，假手术组、模型组给予注射等量生理盐水，共60d。　　1.2.3行为学检测方法Morris水迷宫水池直径150cm，高45cm，水深32cm。平台直径12cm,高30cm,固定于第Ⅲ象限。摄像镜头安放于水池中心上方2m处。于造模后60d进行，共7d，分定位航行实验和空间探索实验。训练前24h，大鼠迷宫中自由游泳3min熟悉环境。

6、第1～6天进行定向航行实验，第7天进行空间探索实验：撤去站台，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录120s穿越站台次数。　　1.2.4海马谷氨酸含量检测行为学检测结束后，各组中随机取6只大鼠，麻醉下断头取脑，立即用4℃9生理盐水冲洗脑组织，除去血液，并迅速在冰盘上分离双侧海马，滤纸拭干，称湿重后，按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，按试剂盒步骤测总蛋白量及谷氨酸含量。　　1.2.5免疫组织化学染色各组中其余6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后迅速剖开胸腔暴露心脏，将穿刺针经左心室插入升主动脉，灌注生理盐水约100ml，待血色变淡后继以4%多聚甲醛的0.1mol/

7、LPBS(pH7.4)液灌注固定后断头取脑，将全脑依次移入含20%和30%蔗糖的PBS中进行梯度固定，置于4℃冰箱中至组织块沉烧杯底后，取大鼠前囟后3～3.8mm区海马组织，作冰冻冠状连续切片，片厚30μm，进行免疫组织化学染色，光镜下观察GABA受体的表达，并统计CA1区GABA阳性细胞数均值。　　1.3统计学处理实验数据用STATA10.0统计软件处理，统计结果以x±s表示，进行方差分析和两两比较。　　2结果　　2.1定位航行实验中潜伏期的比较模型组与假手术组比较：第1天平均逃避潜伏期即明显延长(P<0.05);从第2天开始差异更显著(P<0.0