camk ii在脊髓背角ltp中调节ampa受体glur1亚单位的磷酸化

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1、CaMKII在脊髓背角LTP中调节AMPA受体GluR1亚单位的磷酸化作者：信文君，许继田，宫庆娟，魏绪红，张彤，李永勇，刘先国【摘要】【目的】研究钙/钙调素调依赖性蛋白激酶II（CaMKII）在大鼠脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(LTP)中对α-氨基羟甲基异噁唑丙酸(AMPA)受体GluR1亚单位磷酸化的影响，探讨长时程增强的分子机制。【方法】利用电生理和Westernblot方法，检测脊髓背角LTP后30min和3hAMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845位点磷酸化水平，同时在强直刺激前，脊髓局部给予CaMKII特异性抑制剂K

2、N-93，检测GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平变化。【结果】强直刺激后30min、3h，脊髓背角AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平明显增加。脊髓背角局部给予KN-93，阻断了LTP的诱导并且也阻止了GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平的增加。【结论】强直刺激可导致GluR1亚单位Ser831和Ser845激活且它的激活可能是通过CaMKII来实现的。【关键词】钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ;长时程增强；GluR1；KN-93；磷酸化作用；脊髓背角11[JSUNYat-senUniv(MedS

3、ci),2007,28(3):241-245]长时程增强（long-termpotentiation,LTP）是突触传递效率的长时程增强，海马LTP被认为是学习和记忆的突触模型[1]，由于C纤维与脊髓背角浅层神经元形成突触联系传导伤害感受信息[2]，因此电刺激C纤维或者是神经损伤引起的脊髓背角LTP被认为是痛记忆的一种形式[3]，一些在海马LTP中起关键作用的细胞内信号转导途径，如蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、钙调依赖性蛋白激酶II（CaMKII）等，在脊髓背角LTP中也有作用[4，5]。由于CaMKII在中枢神经系统中分布广泛，且

4、在与记忆有关的海马脑区密度非常高，因此CaMKII被认为是与LTP和记忆最为密切的激酶[6]。CaMKII的磷酸化对于海马LTP是非常关键，它的激活可导致细胞内Ca2+浓度升高，且抑制剂可阻止LTP诱导。CaMKII的激活能够磷酸化AMPA受体[7]，从而提高它的单通道电导性。AMPA受体是GluR1～GluR44个亚单位组成的多聚体，在海马LTP中介导快速的突触电流[8]。在所有的AMPA受体亚单位中，GluR1对于成熟动物海马LTP的建立非常重要[9]。GluR1有两个主要的磷酸化位点，Ser831和Ser845，它们的磷酸化作用可改变AMP

5、A受体的功能。体外研究已经证实，CaMKII可以使GluR1Ser831发生磷酸化，而PKA可磷酸化Ser845位点[10]。11脊髓背角C纤维诱发电位LTP与海马LTP和中枢敏感化有相同的机制[11]。然而，在脊髓LTP中，目前还没有证据显示GluR1哪一个位点被激活，我们先前的研究已经发现CaMKII在脊髓LTP的诱导和维持起关键作用，但CaMKII是否也影响AMPA受体的磷酸化水平[5]，这依然不太清楚。因此，本研究将检测（1）脊髓背角LTP期间，GluR1可能被激活的位点；（2）强直刺激后，脊髓局部应用CaMKII选择性抑制剂KN－93是

6、否抑制GluR1磷酸化水平的升高。1材料和方法1.1实验动物与试剂体质量250~280g的SD雄性大鼠，由中山大学实验动物中心提供，分笼饲养。KN-93购于sigma公司，溶解于少量二甲亚枫（DMSO），配制成1mmol/L的储存液，后用ACSF稀释成工作浓度(100μmol)，DMSO的终浓度不超过0.5％。1.2手术准备及电生理记录乌拉坦（1.511g/kg）腹腔注射麻醉，行常规气管插管和颈静脉插管，在腰4～腰6（L4～L6）间行椎板切除术，暴露腰膨大。游离左侧坐骨神经，使用双极氯化银电极刺激坐骨神经。除用于记录的脊髓节段外，暴露的神经组织均

7、用石蜡油覆盖。颈外动脉插管持续监测动脉血压10.67~13.33kPa(80～100mmHg)。用热反馈系统使大鼠肛温维持在37.0~37.5℃。脊髓背角C纤维诱发电位的记录方法如文献所述[12]。用钨丝微电极（电阻0.5~1MΩ）进行细胞外记录，电极深度在脊髓表面下100~500?滋m。用数/模转换器（DT2821-F-16SE）以10kHz的速度处理和储存数据。以C纤维诱发电位的幅度作为参数。单方波（10~20V，0.5ms，1min-1）刺激分离的左侧坐骨神经诱发脊髓背角电位，强直刺激（40V，0.5ms，100Hz，持续1s，间隔10s，

8、4次）诱导C纤维诱发电位LTP。坐骨神经的刺激点到脊髓背角的记录点约为11cm。1.3Westernblotting方法如文献所述[5，