溺毒清合剂延缓慢性肾功能衰竭的实验研究

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1、溺毒清合剂延缓慢性肾功能衰竭的实验研究周富明李玉卿韦先进费德升张忠贤张雪峰丁伟伟成信法陈华摘要：目的：探讨溺毒清合剂延缓慢性肾衰的作用机理。方法：采用5/6肾切除造模方法复制大鼠慢性肾功能衰竭模型，实验分为假手术组、模型组、溺毒清低剂量组（简称溺低组）、溺毒清高剂量组（简称溺高组）、厄贝沙坦对照组（简称厄贝组）。对各组进行干预治疗，然后观察其肾功能变化。并进行血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA）、一氧化氮(NO）、一氧化氮酶(ET-1）检测，并对肾组织经行IV胶原、纤维连接蛋白(FN）、基质金属蛋白酶-2(MMP-2）、转化生长因子-β(TGF-β）等免疫

2、组化检测，最后行肾组织病理检查。结果：溺毒清合剂可显著降低CRF大鼠ET-1，升高NO，对MDA、SOD差异无统计学意义，改善肾功能方面与厄贝沙坦相当。免疫组化显示溺毒清高剂量组比模型组IV胶原、FN、MMP-2、TGF-β表达减少。结论：溺毒清合剂可显著改善CRF大鼠的肾功能，可能与其改善肾血流，降低血浆ET-1升高NO水平，从而抑制肾小球系膜细胞及间质细胞增值，通过降解Ⅳ型胶原等细胞外基质而抑制5／6肾切除大鼠残肾组织肾小球硬化，从而延缓慢性肾衰进展，与厄贝沙坦有相近的肾脏保护作用。关键词：溺毒清合剂；慢性肾衰竭；大鼠；慢性肾功能衰竭（chronicrenalf

3、ailure，CRF）是危害人们身体健康的危重病之一。我们根据其临床表现，以中医理论为指导，衷中参西，研制成溺毒剂用于CRF，经临床观察溺毒清合剂对CRF患者改善症状、延缓肾衰竭进展疗效理想。为了探讨溺毒清合剂治疗慢性肾衰的作用机理，我们进行了相关的动物实验。材料与方法1材料1.1实验药物：溺毒清合剂（黄芪、制大黄、仙灵脾、丹参、附片、牡蛎）组成，按临床处方比例制成，制剂方法参照文献[1]。溺毒清合剂低剂量组每毫升含生药0.75g，溺毒清合剂高剂量组每毫升含生药1.5g/ml，4℃冰箱保存。对照组服用药物：厄贝沙坦：江苏恒瑞药业股份有限公司生产，150mg/片，制成

4、混悬液，每毫升含原药10mg。1.2实验动物：选用50只雄性的体重为（200±20）g的SD大鼠（浙江中医药大学提供）。1.3实验环境：浙江中医药大学实验动物中心清洁级大鼠饲养室。1.4主要试剂及仪器：日本产7020自动生化分析仪，日本希森Ｋ21自动生化分析仪，752分光光度计，SOD、MDA、NO、ET-1试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。2方法2.1模型制作：50只大鼠先饲养一周，然后随机抽出10只作为假手术组，其余40只在腹腔注射麻醉下，对左侧肾脏进行大部分切除，所切除部分重量占单侧肾脏重量的2/3(0.6～0.7g)，术后两周对右侧肾脏进行全部切除。随机抽

5、出的10只大鼠同样进行以上造模步骤，但不切除肾脏。2.2实验分组：除假手术组外，造模后大鼠随机分为4个组即：模型组、溺毒清低剂量组（简称溺低组）、溺毒清高剂量组（简称溺高组）、厄贝沙坦对照组（简称厄贝组）。2.3用药方法：分好组后实验大鼠以每笼5～6只饲养，自动饮水，自由进食，饲料予以普通饲料。溺毒清合剂低剂量组每日灌服含生药0.75g/ml溺毒清合剂1.0ml/100gBW，给药剂量为7.5g/kg（为临床给药剂量的10倍）；溺毒清合剂高剂量组每日灌服含生药1.5g/ml溺毒清合剂1.0ml/100gBW，给药剂量为15g/kg（为临床给药剂量的20倍）；厄贝沙坦

6、对照组每日灌服含10mg/ml的厄贝沙坦溶液1.0ml/100gBW，给药剂量为50mg/kg（为临床给药剂量的10倍）。假手术组、模型对照组均每日灌服无菌蒸馏水1.0ml/100gBW。2.4观察指标及检测方法：给药8周后，各组大鼠上代谢笼，测定大鼠的采食量、饮水量和尿量，并测定尿液中肌酐、尿素氮和总蛋白；用3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，心脏采血6ml，分离血清，自动生化仪测定血肌酐、尿素氮、胆固醇、三酰甘油，取肾脏标本甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化查Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN),转化生长因子（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-2(MMP2)；超氧化

7、物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮酶（ET-10检测，在浙江中医药大学实验动物中心检验室进行检测，严格按照试剂盒说明操作。肾脏标本用中性甲醛固定，石蜡包埋，常规苏木-伊红（HE）染色，切片3µm，光镜下观察。均有浙江中医药大学协助完成。2.5免疫组化检测：用SABC法测定肾组织中Ⅳ型胶原、FN,TGF-β1、MMP-2的表达。采用图像分析系统，系统定标，每张标本按顺序选5个视野，计算每个视野内染色区域的面积及积分光密度，以均值计算每个标本的面积及积分总光密度，最后以每组的均值进行比较。3统计方法用SPSS13.0统计软件计算，所有数