植物愈伤组织培养实验设计方案

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1、植物愈伤组织培养实验设计方案组员：陈林超、陈思超、杨芳、徐国政、萧宇超、郑剑一、实验目的：1、掌握培养基配制方法及灭菌技术2、掌握外植体灭菌的基本方法以及无菌操作技术3、掌握实验结果的统计方法并学会分析二、实验原理：植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦

2、脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。三、材料的准备：1、前期器材准备：烧杯（100ml3个，用于放初步处理后的外植体；1L1个，用作废液缸；250ml3个，包好牛皮纸后灭菌，分别装酒精、升汞和无菌水）、电子天平、称量纸（若

3、干）、钥匙（若干）、玻璃棒（一根）、量筒（100ml和10ml各1个），胶头滴管（1个）、陶瓷烧杯（1L1个）、电炉（配有石棉网）、酸性ph试纸、锥形瓶（250ml4个，用于配置专属培养基；500ml2个，装无菌水；100ml40个，用于接种）、皮筋（或棉绳，若干）、牛皮纸（40+2+2，按锥形瓶口和烧杯口大小裁好）、记号笔（或标签纸）、培养皿（10套）、铁质饭盒内装操作工具（手术刀柄2个、手术剪1个、长形镊子2个，小型镊子2个）、吸水纸（若干）、脱脂棉、滤纸（若干）、高压灭菌锅、超净工作台、保鲜膜、

4、酒精灯、打火机、手术刀片（2片）、人工气候箱2、前期药品配置：75%酒精、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、铁盐母液、无菌水、0.1%HgCl2、乙醇、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA3、实验材料：月季、仙人掌、芦荟四、实验步骤：1、各种实验器材的准备及清洗2、各种母液的配置：类型成分培养基中配置母液母液体积配1L培养基扩大倍数工作液称取量gml吸取量/ml浓度mg/L大量元素NH4NO3165016500　　KNO3190019000　　CaCl2·2H2

5、O44044001000100100　　MgSO4·7H2O3703700　　KH2PO41701700微量元素KI0.8383　　H3BO36.2620　　MnSO4·4H2O22.32230　　ZnSO4·7H2O8.6860100010100　　Na2MoO4·2H2O0.2525　　CuSO4·5H2O0.0252.5　　CoCl2·6H2O0.0252.5铁盐FeSO4·7H2O27.82780100010100　　Na2-EDTA37.33730有机物质肌醇1005000　烟酸　　0.52

6、5盐酸吡哆素0.5255001050　　盐酸硫胺素0.420　　甘氨酸2.01003、MS培养基的配置：取容量为1L的搪瓷杯，先加入600ml的蒸馏水，放在电炉上进行加热，后依次加入100ml大量元素母液、10ml微量元素母液、5ml铁盐母液、10ml有机物母液、30g蔗糖和9g琼脂粉。注意：1）要在前种物质全部溶解后才能加入后种物质。2）加热过程中要不停地搅拌。当半成品的溶液沸腾时立即从电炉上取下搪瓷杯，放在实验桌上，用玻璃棒沾取少量的液体滴在酸性ph试纸上，用0.1mol/L的NaOH或0.1mo

7、l/L的HCl调整液体的pH至5.6—5.8，最后在搪瓷杯中用蒸馏水定容至1L。4、培养基的分装：将1L的MS培养基分装到4个250ml的锥形瓶中，分别配成四个组的专属培养基，并各自倒入10个25ml的小锥形瓶中，用2层牛皮纸包好并用皮筋扎好，最后用记号笔做好记号1）对照组：MS培养基，不加任何激素2）月季：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L3）仙人掌：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L4）芦荟：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L3、材料预处理：1）月季

8、：选取其生长健壮的当年生枝条，有饱满而未萌发的侧芽，剪去顶部和基部并去叶，用洗衣粉水溶液轻轻洗涤，放到烧杯中流水冲洗2）仙人掌：选择大小适中的仙人掌放入烧杯中流水冲洗3）芦荟：选取芦荟3年生带花植株,放到烧杯中用流水冲洗30min后倒置烧杯，使多余的水流出，拿掉纱布后用吸水纸吸干植株外表面的水分，最后放入已消毒好的超净工作台中6、灭菌：1）培养基及器具灭菌：培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，时间为30mi