水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立.

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水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立1：研究的目的和意义1.1：研究的目的1.1.1.以水稻成熟胚为外植体，寻求一个科学的实验方法，探讨愈伤组织的产生规律。1.1.2.用相同的培养方式对不同类型的籼稻品种和粳稻品种成熟胚进行组织培养，比较不同类型的水稻品种成熟胚愈伤组织诱导率之间的差异。1.1.3.通过植株再生培养体系,寻求提高水稻成熟胚的再生频率的方法，建立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系。1.2：研究的意义1.2.1.水稻种子是水稻组织培养研究中使用最早的外植体,与其它外植体相比,种子胚具有再生周期短,再生植株育性好,取材不受生长季节的限制,灭菌容易,外植体均匀,重复性好等优点,因而是一种理想的研究材料。但种子胚也存在诱导率不高,品种差异明显等限制因素[1]。为了不断优化该体系的各个环节,人们做了大量研究,有关的研究报道也较多。杨跃生等[2]以籼稻栽培种成熟胚诱导形成的愈伤组织为材料,对影响植株再生的一些因素进行了研究。发现与N6相比MS培养基中的无机大量成分严重抑制再生植株根系生长,但MS的无机微量成份对诱导植株再生的效果则较明显。较高浓度的BA利于诱导更多的植株再生,而较低的BA浓度则利于壮苗和植株根系的形成。增加诱导培养基或分化培养基中的渗透压和琼脂浓度,维代培养时加入适量的激动素或6-节基氨基嚓吟以及在分化培养基中加入活性炭、玉米素和AgNO3等均可提高水稻愈伤组织的分化成苗率[3]。另有研究则发现脱水处理能有效促进水稻愈伤组织的植株再生[4-6]。目前用于作物转基因的外植体,主要有胚性悬浮细胞系,成熟胚愈伤组织,幼胚及其愈伤组织,花药愈伤组织,分生组织盘,萌发的胚!叶或根,茎尖分生组织等,其中成熟胚具有取材方便,不受季节的限制,在转基因研究中有着较为广阔的应用前景，但是到现在为止,适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立,特别是釉稻品种成熟胚的组织培养效果很差,因此,严重影响了籼稻基因工程的开展，为此,进行籼稻愈伤组织的高频率诱导,胚性愈伤组织的保持及高频率绿苗分化的研究,是一项极其重要的水稻细胞工程和基因工程研究的基础工作，因此,研究籼稻成熟胚的组织培养特性,建立杂交水稻亲本成熟胚再生体系具有极其重要的理论和现实意义。 花药培养是水稻组织培养研究和应用较多的外植体,并已经取得了喜人的成果。自从Guha妞和Maheshwari首次从植物花药培养出再生植株以来,目前世界上已有260多种植物成功地获得了花粉植株[9]。仅我国在水稻上选育的品种就有60多个,小麦20多个,推广面积已达179万公顷,增产创收约5亿元[7]。通过花药培养可以加速后代纯合、快速组合多种性状、缩短育种进程、简化选育程序。然而,水稻花药培养的愈伤组织诱导率相当低,籼稻花药组织培养的诱导率一般不超过5%,且幼苗白化率高,绿苗率低于1%[8]。2：国内外研究的动态2.1.基因型对水稻成熟胚培养的影响基因型是影响水稻品种再生能力的最关键因素之一，在同一培养条件下,愈伤组织诱导率和再生率在不同水稻品种之间存在很大的差异。王志成[10]以扬稻6号和培矮645成熟胚为实验材料,MS为诱导培养基,发现该2个品种在同一培养基上的诱导率存在很大差异,扬稻6号的为72.33%,而培矮645的为49.45%。向阳[11]等人以粕稻品CDR22，Duoxi，K17B成熟胚为实验材料,DNB为培养基诱导愈伤组织。发现3个不同釉稻品种的诱导率存在很大差异,其中CDR22的诱导率达到80%,而Duoxi的为73%,K17B的为35.5%。肖向文[12]等人以蜀恢527，给恢20号，给恢35号，给恢101，R21等5个籼稻品种为实验材料,比较这些籼稻品种愈伤组织在同一培养基上的再生频率,其中绍恢35号再生率最高为35.5%,缙恢101最低的仅为5%。因此可见不同类型的釉稻品种对同一培养条件的反应差异很大,究其原因主要是不同品种之间基因型差异导致不同品种对同一培养条件反应之间的差异。2.2.外源激素对粕稻成熟胚培养的影响外源激素是培养基的极其重要成分,对启动细胞分裂,分化和器官发生具有重要作用。其中2,4一二氯苯氧乙酸(2,4-D)是植物组织培养中最常用的愈伤组织诱导剂,它能有效地诱导植物细胞的脱分化。2.3.培养基对粕稻成熟胚组织培养的影响在植物组织培养中常用的培养基有N6,B5,CC,MS等。在组织培养过程中,各种不同成分的培养基对同一外植体材料造成了培养力的差异。易自力[13]等人通过研究认为CC培养基比较适合籼稻愈伤组织的诱导和继代。但是,不同籼稻品种采用同样的CC培养基,不同品种之间的诱导率仍然产生很大的差异。所以,我们可以根据各种不同培养基成分的特点进行搭配以组合成新的培养基来提高籼稻品种成熟胚愈伤组织诱导率。马炳田[14]等人以N6大量元素,MS微量元素。B5有机成分组合成NMB培养基,对蜀恢527，蜀恢163，蜀881， R128，D62B等杂交籼稻亲本品种的成熟胚进行愈伤组织的诱导,获得了较高的诱导率。周玲艳[15]等人以MS大量元素，BS微量，有机元素组合成MB培养基,对籼稻品种培矮64S成熟胚进行愈伤组织诱导,获得了较高的诱导率。此外培养基对愈伤组织继代和分化阶段也产生很重要的影响。研究结果表明,在愈伤组织继代阶段,采用不同培养基交替继代方式有利于愈伤组织胚性状态的保持；在愈伤组织分化阶段,在不同分化培养基的愈伤组织的分化率差异显著阴,可见,在籼稻成熟胚组织培养过程中,不同品种及不同培养阶段所需营养元素的成分差别很大,因此,在对不同的粕稻品种成熟胚进行组织培养时,首先应筛选出适合其培养的培养基。2.4.存在的问题2.4.1.水稻成熟胚组织培养技术虽然发展快,到目前为止已经取得了一定的积极成果,但是，还没有建立起一套完整而有效的水稻成熟胚组织培养再生体系。这主要是因为水稻成熟胚组织培养受其外植体基因型的影响特别大,不同水稻品种对同一组织培养条件的反应有极大的差异。因此,必须加强水稻基因型与成熟胚培养力的内在关系研究,以便从基因水平上提高釉稻成熟胚的培养力。2.4.2.水稻成熟胚组织培养的愈伤组织诱导率较低,继代易褐化,而月愈伤组织的胚性状态不好,严重阻碍了基因工程在水稻品种改良上的应用,。因此,应加强提高其愈伤组织诱导率，降低愈伤组织褐化率和提高愈伤组织胚性状态的研究。2.4.3.水稻成熟胚组织培养愈伤组织的分化率较低,加大了试验工作量,延长了研究周期。因此,还应深入进行提高愈伤组织分化率的研究。3.主要研究的内容3.1不同水稻品种愈伤组织的诱导。3.2.愈伤组织的继代增值。3.3.水稻不定芽的诱导与增值。3.4.生根培养和炼描移栽。4.材料和方法4.1.材料本试验所用材料由西南科技大学植物分子育种实验室提供，常规籼稻品种：常规粳稻品种：4.2.方法 4.2.1.培养基诱导愈伤组织培养基：MS+2，4-D+VB1（不同的浓度）+30g/L蔗糖+0.7%琼脂粉。pH5.8（见下表一）表一：两种主要生长调节物质及VB1组合配比表及愈伤组织诱导率编号2,4-D/(mg·L-1)6-BA(mg·L-1)VB1/(mg·L-1)平均愈伤率/%12.000.522.00.21.032.50.52.042.50.22.052.50.50.563.001.073.00.51.085.002.095.00.20.5表二：不同浓度的2,4-D对水稻愈伤组织诱导率的影响2.4-D浓度(mg·L-1)品种一品种二品种三总胚数萌发率/%诱导率/%总胚数萌发率/%诱导率/%总胚数萌发率/%诱导率/%0.11000.51001.01001.510021002.51003.01005.0100 继代培养基：MS+2，4-D（3.0mg/L）+ABA（不同浓度）+30g/L蔗糖+0.7%琼脂粉，pH5.8(见下表三)。mg·L-1表三：ABA对愈伤组织生长的影响编号ABA/(mg·L-1)愈伤组织块数量/块胚性愈伤组织百分率/%1020.130.240.350.460.5分化培养基：MS+6-BA（不同的浓度）+KT（不同的浓度）+NAA（不同的浓度）+30g/L蔗糖+0.7%琼脂粉，pH5.8（见下表四）。表四：6-BA、KT、NAA的不同配比对胚性愈伤组织分化的影响编号6-BA/(mg·L-1)KT/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)组织块数量/块分化率/%10.52.00.120.54.00.330.56.01.041.02.00.151.04.00.361.06.01.072.02.00.182.04.00.3 92.06.01.0表五：诱导培养基中加6-BA对愈伤组织分化不定芽的影响6-BA浓度(mg·L-1)品种一品种二品种三愈伤组织数再生组织数再生组织率愈伤组织数再生组织数再生组织率愈伤组织数再生组织数再生组织率0.50.51.01.02.02.0表六：培养基继代对愈伤组织分化芽的影响品种重复次数愈伤组织数芽诱导率/%芽数/块诱导效率/%品种一12品种二12品种三12生根培养基：1/2MS+NAA（0.2mg/L）+30g/L蔗+0.7%琼脂粉，pH5.84.2.2.愈伤组织诱导选取有生活力的饱满种子，在超净工作台上用浓度为75%的酒精消毒2min，无菌水冲洗3～5次后用0.1%升汞消毒15～20min，再用无菌水冲洗3～4遍，置于适量无菌水中浸泡16～20h，倒出水，置于铺有滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出成熟胚。盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿接种30～50粒成熟胚。4.2.3.分化选取浅黄色、颗粒状、质地较坚硬密实的愈伤组织,接种到预分化培养基上,进行预分化 培养,26℃,暗培养2周;再接种到分化培养基上,进行分化培养,26℃,每天光照16h。4.2.4.根的诱导查文献，筛选资源，确定材料籼稻愈伤诱导粳稻愈伤诱导初代愈伤愈伤继代培养芽的诱导根的诱导植株再生增值培养炼苗，驯化，移栽立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系不同生长调节剂处理不同生长调节剂处理比较籼稻和粳稻之间的诱导率当愈伤组织在分化培养基上产生的绿芽长到Zcm高时,小心地将绿芽转接到生根培养基上,进行生根培养,26℃,每天光照16h.当根长到约3cm长,苗高12一15cm时将培养瓶移至室外,打开瓶盖,进行炼苗.炼苗2一3d后取出小苗,小自洗去根部培养基,使用盆栽的方法进行培养。5.技术路线图 参考文献：[1].伍成祥,宛煌禽,徐俊等.水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织再生体系的建立[J].2002,23（3）:88-94[2].杨跃生,简玉瑜.影响水稻愈伤组织再生植株数量和质量的因素[J].农业生物技术学报,1996,4(2):124-128.[3].王力,张云孙,陈屹等.影响水稻愈伤组织植株再生频率的因素研究[J].云南大学学报(自然科学版),1999,21(2):113-115.[4].赵成章,吴连斌.干燥处理对水稻愈伤组织绿苗再生和若干生理生化特性的影响[J].作物学报,1997,23(l):39-43.[5].谭光轩,舒理慧,袁文静等.干燥处理对野生稻愈伤组织绿苗分化率和某些生化指标的影响[J].武汉大学学报.1997,45(4):455-459.[6].MasayoshiT,TakayasuH,HarukoMEffectofculturemethodsonthere-generationofalbinoriee(oryzasativaL·)Plant)ets[J].PlantCellRePorts,1996,15:597-600.[7].朱至清.试论禾谷类的细胞培养与N6培养基[J1.植物杂志,1998,4:15.[8].陈英,李向辉,孙勇如.植物细胞培养与遗传操作[M].长沙:湖南科学出版社,1992[9].张宗琼,水稻成熟胚高频再生体系的建立及其生理生化特性的研究[D].广西，广西大学，2004,8-14.[10].王志成,易自力,皮灿辉,等.两种水稻优良亲本高频离体再生系统的建立[J].扬州大学学报.(农业与生命科学版),2004,25(3):33-37.[11].向阳,赵德刚,朱冬雪,等.粕稻成熟胚愈伤组织诱导及不定芽分化[J].山地农业生物学报，2004,23(3):193-197.[12].肖向文,李平,杨正林,等.5个骨干釉型恢复系再生能力的比较研究[J].西南农业大学学报(自然科学版),2005,27(3):378-381.[13].易自力,严钦泉,邓启云,等.几种水稻粕型恢复系和不育系离体培养和遗传转化的研究[J].湖南大学学报(自然科学版),2002,29(1):1-7.[14].马炳田,李平,周开达,等.杂交釉稻亲本愈伤组织培养力的研究[J].四川农业大学学报,2002,20(3):189-193.[15].周玲艳,姜大刚,吴豪,等.几个光温敏核不育水稻品种组织培养特性的研究[J].华南农业 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