盐藻细胞dsrab蛋白的诱导表达及纯化

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1、精选公文范文管理资料盐藻细胞DsRab蛋白的诱导表达及纯化　　盐生杜氏藻（Dunaliellasalina，以下简称盐藻）的细胞结构简单，具有很强的抗盐能力，可以生长在5.0mol/LNaCl培养液中，而且其培养条件也很简单。因此，盐藻是研究植物耐盐分子机制的重要模式生物。研究表明当盐藻在高盐环境胁迫下，体内的蛋白质合成和降解以及能量代谢等多种代谢途径会发生很大程度的改变，其中耐盐作用主要是依靠盐藻中Na+/H+泵和大量合成兼容性溶质甘油，但应答盐胁迫的调控过程还少有报道。从信号传导方面开展对盐藻抗盐生理调节过程的研究，有助于全面了解盐藻耐盐机制。　　小G蛋白（SmallGTP

2、-bindingproteins）分子量一般在20-30kD之间，以单体形式普遍存在于真核生物中，通过激活态（结合GTP）与非激活态（结合[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料GDP）的转变来行使分子开关作用，参与重要的细胞生理活动，包括信号传导、细胞增殖、囊泡转运、细胞骨架重组等。Rab蛋白是小G蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran5个亚家族）中最大的亚家族，近年来在酵母、果蝇、拟南芥、烟草、水稻等真核生物中发现的Rab蛋白遍布于胞内的各个膜区室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab蛋白定位于特定的细胞器膜上，参与膜泡的形成、定向转运、锚定链

3、接等过程。现已发现许多与植物的抗逆性有关的Rab蛋白，其表达量会受到盐胁迫、低温、干旱等逆境条件的影响。因此，深入了解Rab蛋白功能及进一步研究植物抗逆性相关蛋白的相互作用网络具有重要科学意义。　　本实验室已从盐藻细胞中成功克隆出新的Rab蛋白基因DsRab（GenBankAccessionNo.JN989548），并用实时荧光定量PCR方法研究了DsRab基因在盐胁迫下的表达情况，证明DsRab是一个盐诱导上调基因。本试验构建重组表达载体pGS-21a-DsRab，通过优化诱导表达条件使[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料DsRab蛋白在上清中的表达量增加

4、，利用GST-SefinoseTMKit纯化，获得纯度较高的可溶性融合蛋白，为制备抗体以及进一步在蛋白质水平上研究该蛋白在盐藻耐盐性机制中的作用奠定基础。　　1、材料与方法　　1.1材料　　1.1.1菌种和质粒大肠杆菌（E.coli）菌株DH5α、E.coliBL21（DE3）、质粒pGS-21a由本室保存；pMD18-TSimpleVector购自TaKaRa公司。　　1.1.2试剂限制性内切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4连接酶购自TaKaRa，硝酸纤维素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型单组分TMB底物溶液购自TIANGEN，GST-Se

5、finoseTMKit（BSP032-7），Pr-estainedProteinMolecularWeightMarker购自生工生物工程（上海）有限公司，凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1原核表达载体的构建[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料根据DsRab基因cDNA全长序列（GenBankAccessionNo.JN989548）设计引物并加入酶切位点，上游引物（含EcoRI酶切位点）P1：5’-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3’，下游引物（含SalI酶切位点）P

6、2：5’-GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3’。以总RNA反转录的cDNA为模板，P1，P2为引物进行PCR扩增。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸9min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，回收目的片段，连接到pMD18-Tsimple载体上（T-A克隆），构建重组质粒pMD18-DsRab，转化E.coliDH5α感受态，在Amp抗性平板上筛选阳性单克隆。用EcoRI、SalI双酶切目的片段和pGS-21a质粒，用T4连接酶连接，构建表达载体pGS-21a-DsRab，

7、转化E.coliDH5α[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料感受态，筛选阳性单克隆，交由大连宝生物公司测序，以验证读码框的正确性。　　1.2.2融合蛋白的原核表达将测序鉴定正确的表达质粒pGS-21a-DsRab转化E.coliBL21（DE3），挑取阳性单克隆，接种于5mL含氨苄青霉素（50mg/L）的LB液体培养基中，37℃过夜培养。次日，按1%的比例接种到5mL新的LB液体培养基（氨苄青霉素50mg/L）中，37℃振荡培养到菌液OD600=0.6-0.8时，试验组加