HPLC法测定万寿菊茎中叶黄素的含量.doc

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1、HPLC法测定万寿菊茎中叶黄素的含量作者：曹洪昭聂传平李红玉【摘要】目的：建立一种测定万寿菊茎中叶黄素含量的HPLC方法。方法：采用DiamonsilC18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇∶水=97.5∶2.5，流速：1.0mL/min，检测波长：445nm。结果：叶黄素在1.92～96μg/mL范围内，有良好的线性关系(r=0.9996)，平均回收率为98.9%，RSD1.04%。结论：该法简便准确、重现性好，可用于万寿菊茎中叶黄素的含量测定。【关键词】万寿菊茎;叶黄素;高

2、效液相色谱;含量测定叶黄素(lutein)是胡萝卜素的衍生物，是一种优良的抗氧化剂，在老年性黄斑退化病和白内障疾病防治方面具有重要的作用[1，2]。此外，叶黄素还具有预防心血管疾病、抗癌和提高机体免疫力等功能[3]。1g叶黄素的价格与1g黄金的价格相同，因此又名“植物黄金”。目前叶黄素主要从万寿菊干花中提取、检测，而对万寿菊茎中叶黄素含量的测定研究未见报道。我国在新疆、内蒙古、黑龙江等地区建立了大面积的万寿菊种植基地，但是大量的万寿菊茎、叶被作为废弃物而未被利用。因此，研究、开发富含叶黄素的新天然资

3、源，测定万寿菊茎中叶黄素的含量具有重要的现实意义。同时，为广大万寿菊种植者和加工企业变废为宝，做一点有益的探索。　　1仪器与试药　　1.1仪器　　UV2550紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);RE5298A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);P680型高效液相色谱仪(戴安中国有限公司);SKQ2200超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司);D2F6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。　　1.2试药　　实验所用万寿菊茎采自辽宁医学院药园，采摘后切碎、洗净，常温干燥至恒重，粉碎过20目

4、筛以备用;叶黄素对照品(上海顺勃生物工程技术有限公司，含量≥95%)。　　2方法与结果　　2.1对照品溶液的配制　　精密称取叶黄素标准品4.8mg置25mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。置于阴凉避光处保存。4　　2.2供试品溶液得配制　　2.2.1提取取万寿菊茎适量，研磨成粉末，过20目筛，称取粉末10g置于500mL烧瓶中，加入石油醚∶无水乙醇(3∶l)混合溶剂250mL，提取温度50℃，超声振荡提取20min。过滤，除去滤渣，将滤液置于分液漏斗中。分离石油醚层，将其旋转蒸发浓缩。　　2.

5、2.2皂化在浓缩液中加人20%的氢氧化钾甲醇溶液5mL，60℃水浴加热，反应6小时。用10%的盐酸调节pH值至中性，过滤，滤渣用适量的冷水和正己烷洗涤。　　2.2.3重结晶将2.2.2项下制得的滤渣溶于二氯甲烷中制得饱和溶液，向饱和溶液中慢慢逐滴加入适量的正己烷，放入冰箱中于5℃静置过夜。次日，在4000r/min的条件下离心10min，得到的沉淀物用氮气吹干，用甲醇溶解于100mL棕色容量瓶中，摇匀，得供试品溶液，阴凉避光保存。　　2.3色谱条件的考察　　色谱柱：DiamonsilC18(20

6、0mm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇∶水=97.5∶2.5;流速：1.0mL·min-1;检测波长：445nm;柱温：室温(25℃);进样量：20μL;定量方法：外标法;理论塔板数以叶黄素峰计算，不低于8000。　　2.4线性关系的考察　　精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5mL，分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样量20μL。以峰面积(Y)为纵坐标，叶黄素浓度(X)为横坐标建立标准曲线，回归方程为Y=0.785X+1.3466，R2=0.9996。由图1可知叶

7、黄素浓度在1.92～96μg/mL范围内，呈良好的线性关系。　　2.5精密度试验　　精密移取叶黄素标准品溶液(28.8μg/mL)重复进样6次，测得叶黄素峰面积，实验结果见表1，结果显示6次测定叶黄素峰面积的RSD为1.7%。　　2.6稳定性试验　　精密移取叶黄素标准品溶液(28.8μg/mL)，每隔2h测1次其中的叶黄素含量。试验结果见表2。结果表明，在10h内叶黄素含量没有发生显著变化，保持稳定。　　2.7重复性试验　　精密移取叶黄素标准品溶液(28.8μ4g/mL)，重复进样6次，测叶黄素峰面

8、积，实验结果见表3。结果显示，6次测定叶黄素峰面积的RSD为0.81%。　　图1叶黄素的HPLC标准曲线表1精密度试验结果表2稳定性试验结果表3重复性试验结果　　2.8加样回收率试验　　取6份已知浓度的叶黄素样品溶液各5mL，分成3组并分别加入不同量的叶黄素标准品，定容至10mL，进样量为20μL。按上述色谱条件进行测定，计算得叶黄素的回收率在97.1%～100.2%之间，平均回收率为98.9%，RSD为1.04%。　　2.9标准品、样品色谱图　　见图2、图3所示。